Projekti / Programi
Identifikacija in ovrednotenje novih biooznačevalcev za delno aktivne rezervoarje virusa HIV.
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B007 |
Biomedicinske vede |
Medicina (človek in vretenčarji) |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
HIV-1, Nef, TAR RNA, mikro RNA, eksosomi, virusni rezervoar, biooznačevalci
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
30767 |
dr. Jana Ferdin |
Naravoslovje |
Vodja |
2016 - 2017 |
53 |
Organizacije (1)
Povzetek
HIV ostaja resen globalen problem, saj je bilo po ocenah WHO do konec leta 2013 z virusom okuženih okoli 35 milijonov prebivalstva. Kljub relativno učinkoviti proti-retrovirusni terapiji (ART), se virus hitro razširi in skrije v majhne rezervoarje po celem telesu okuženih posameznikov, ki lahko na dolgi rok prispevajo k številnim zdravstvenim problemom. Nekateri testi za določanje rezervoarjev virusa HIV že obstajajo, vendar imajo veliko pomanjkljivosti in ena pomembnih je, da virus HIV zaznavajo le na nivoju DNA ali RNA. S tem pristopom ne izvemo ničesar o »aktivnosti« preostalega virusnega rezervoarja, na primer ali so sposobni omejenega prevajanja nekaterih virusnih proteinov ali ne. Protein Nef je eden zgodnji in številčno najbolj izraženih virusnih proteinov. Je ključni patogeni dejavnik virusa HIV, za katerega je znano, da vpliva na delovanje celičnih signalnih in transportnih poti ter spremeni metabolizem celo neokuženih celic. Pomembno je poudariti, da se Nef iz okuženih celic sprošča tudi preko eksosomov in ga je mogoče zaznati tudi v plazmi z virusom HIV okuženih posameznikov. Eksosomi so zunajcelični vezikli (premera 40-100 nm), ki so izločeni iz vseh tipov celic in kultur, prav tako so jih v izobilju dokazali v telesnih tekočinah, kot so kri (3 x 109 eksosomov/µl), likvor ((109 eksosomov/µl), slina, urin, materino mleko in druge. Pomembno je tudi poudariti, da so eksosomi sposobni preiti krvno-možgansko pregrado, njihova proteinska, nukleinska in lipidna sestava pa odraža sestavo in fiziološko stanje izvorne celice. Prav zaradi omenjenih lastnosti, jih intenzivno preučujejo tudi kot biooznačevalce raznolikih bolezni. Pred eksosomi, so miRNA v telesnih tekočinah pritegnile veliko pozornosti kot nova kategorija biooznačevalcev bolezni. Nedavne študije podpirajo idejo, da je velik delež miRNA zapakiranih v eksosome, kjer so zaščitene pred razgradnjo in se tako lahko usmerjeno prenesejo do ciljnih celic/tkiv. Okužba s HIV vpliva tudi na profil izražanja miRNA, ena študija pa je celo dokazala prisotnost HIV-1 TAR (trans-aktivacijski element) miRNA v eksosomih izoliranih iz seruma zdravljenih bolnikov in elitnih nadzornikov virusa.
Naša hipoteza projekta je, da sta koncentracija Nef in/ali izražanje TAR miRNA dober pokazatelj delno aktivnih rezervoarjev virusa HIV pri okuženih posameznikih zdravljeni z ART in elitnih nadzornikih virusa. Profili miRNA in njihove primerjave med različnimi skupinami bolnikov bodo omogočile določitev številnih potencialno novih biooznačevalcev rezervoarja virusa HIV za kasnejše raziskave. Da bi preverili našo hipotezo, bomo najprej pridobili 140 plazemskih vzorcev dobro okarakteriziranih s HIV-om okuženih bolnikov iz SCOPE zbirke (4 skupine: zdravi; okuženi; z ART zdravljeni; elitni nadzorniki virusa). Po optimizaciji komercialno dostopnega testa Nef-ELISA, bomo v vseh vzorcih plazme določili koncentracijo Nef-a. Nato bomo optimizirali izolacijo miRNA iz plazme ali plazemskih eksosomov in določili izražanje TAR miRNA z RT-qPCR z uporabo že objavljenih primerjev in komercialnega kita SYBER qPCR. Na koncu bomo na treh vzorcih plazme iz vsake skupine bolnikov naredili profil izražanja miRNA. Izolirano miRNAs bomo obratno prepisali in analizirali na pred-pripravljenih humanih miRNA PCR ploščah z edinstvenim naborom miRNA sond in kontrol. Dobljene rezultate bomo statistično ovrednotili.
Ugotovitve tega projekta so prvi korak k povsem novemu pristopu diagnostike AIDS-a, ki temelji na molekularnih komponentah eksosomov, kot je Nef in HIV miRNA, v plazmi. Koncentracije Nef v plazmi bi v prihodnosti lahko testirali tudi kot prognostični biooznačevalec s HIV-om povezanih nevrokognitivnih motenj, saj ima Nef že znano vlogo v HIV-nevropatogenezi. Rezultati naše raziskave lahko služijo tudi kot osnova za določitev novih tarč za zdravljenje AIDS-a.
Pomen za razvoj znanosti
Predlagan projekt je prvi korak k povsem novemu pristopu diagnostike AIDS-a, pri katerem bi uporabili pristope za delo z eksosomi, ki se že uporabljajo pri raku (npr. pri glioblastomu). Diagnostika, ki temelji na dokazovanju eksosomov v plazmi je boljša alternativa diagnostičnim postopkov, ki temeljijo na vzorčenju tkiva, saj je manj invazivna, nevarna, hitrejša, enostavnejša in za analizo cenovno ugodnejša. Predlagan pristop je zasnovan na odkrivanju proteina Nef ali HIV/humanih miRNA, ki se po plazmi transportirajo znotraj eksosomov, sproščenih iz sosednjih ali odmaknjenih okuženih celic. Raven biooznačevalcev Nef in miRNAs v plazmi sta tako pokazatelja dogajanja v dostopnih ali bolj oddaljenih delih telesa. Posledično sta zelo dobra biooznačevalca za prisotnost rezervoarjev virusa HIV v telesu. Nekateri testi za določanje rezervoarjev virusa HIV že obstajajo, vendar imajo veliko omejitev in pomanjkljivosti, ena pomembnih je, da virus HIV zaznavajo le na nivoju DNA ali RNA. S tem pristopom ne izvemo ničesar o »aktivnosti« preostalega virusnega rezervoarja, na primer ali so sposobni omejenega prevajanja nekaterih virusnih proteinov, ki imajo že znan patološki učinek. Naše raziskave so pokazale, da so lahko virusni (protein Nef in TAR RNA) kot tudi spremenjeno izražanje profila v plazmi prisotnih miRNA potencialni indikatorji rezervoarjev virusa HIV, ki bi jih posamezno ali v kombinaciji v nadaljevanju lahko testirali kot prognostične biooznačevalece tudi s HIV-om povezanih nevrokognitivnih motenj, saj je do sedaj še neznano, kaj ima ključno vlogo v HIV-nevropatogenezi. Rezultati naše študije bi lahko tudi predstavljali osnovo za iskanje novih tarč za zdravljenje AIDS-a, inhibicijo ali preprečevanje negativnih vplivov virusnih/humanih biooznačevalcev (prostih ali kot del eksosomov) v telesu.
Pomen za razvoj Slovenije
V okviru projekta Z3-7198 smo pomembno prispevali k naslednjim področjem pomembnim za razvoj Slovenije: 1- Pomemben rezultat naše študije je ocena (koncentracij Nef in prisotnosti TAR RNA) virusnih biooznačevalcev ter nivo izražanja specifičnih (miRNA) humanih biooznačevalvcev kot biooznačevalcev za oceno rezervoarjev virusa HIV in preostanka njegove aktivnosti pri zdravljenih HIV-pozitivnih posameznikih. S tem smo pomembno prispevali k razvoju slovenske znanosti tako v splošnem kot tudi specifično na (v svetovnem merilu) zelo novem področju raziskav okužbe z virusom HIV. Rezultate raziskav smo predstavili na številnih mednarodnih kongresih in v okviru vabljenih predavanj na domačih in tujih inštitucijah prispevali k prepoznavnosti slovenske znanosti v mednarodnem znanstvenem okolju. 2- Pomembno smo prispevali tudi k dolgoročnemu izboljšanju zdravljenja in s tem kvalitete življenja posameznikov okuženih z virusom HIV-1, tako v Sloveniji kot tudi drugje v svetu. Pokazali smo namreč, da približno polovica okuženih posameznikov, ki s protivirusno terapijo uspešno vzdržuje virusno RNA v plazmi pod mejo klinične detekcije, v plazmi vsebuje virusni protein Nef. Nef je znan virusni patogen dejavnik, s številnimi negativnimi učinki. Nef v plazmi bi tako lahko prispeval k vnetnim procesom in k z AIDS-om nepovezanimi bolezenskimi stanji, ki se pogosto pojavljajo pri drugače uspešno zdravljenih okuženih posameznikih. V okviru projekta smo optimizirali test za detekcijo Nef-a v plazmi, ki bi lahko identificiral bolnike, pri katerih je potrebna sprememba terapije. Pokazali smo tudi, da bi bili lahko vezikli, ki vsebujejo Nef, pomembna terapevtska tarča. 3- V času projekta smo napisali tudi pregledni članek, ki je bil objavljen v Medicinskih razgledih, v katerem smo strnili trenutno znanje o zunajceličnih veziklih, s poudarkom na opisu vrst zunajceličnih veziklov, metod za njihovo izolacijo in analizo, že znanih bioloških vlog in njihovega kliničnega potenciala. Z objavo tega članka smo zdravnikom in zdravstvenemu osebju in tudi raziskovalcem, ki jim je to področje popolnoma nepoznano, poskušali predstaviti zunajcelične vezikle in njihovo uporabnost na enostaven in pregleden način. Svoje znanje (praktično in teoretično) sem kot delovna mentorica tudi neposredno delila v okviru študentske naloge, katere tematika je bila prepletena s dokazovanjem prisotnosti (virusna TAR RNA) ali ravni izražanja (humana miRNA) potencialno novih virusnih oz. človeških biooznačevalcev prisotnih v plazmi okuženih z virusom HIV-1. Naloga je bila končno nagrajena tudi s fakultetno Prešernovo nagrado ter nominirana za univerzitetno Prešernovo nalogo.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
