Projekti / Programi
Orodja za genski inženiring
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.00 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
CRISPR, Lambda Red, TALE, rekombiniring, genski inženiring, genom, homologna rekombinacija, točkovna mutacija, transkripcijski represor, mutageneza
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
32254 |
dr. Rok Gaber |
Biotehnologija |
Vodja |
2016 |
52 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
20.996 |
Povzetek
Zaradi razvoja novih metod nukleotidnega sekveniranja, sinteze genomov, razvoja proteomskih in metabolomskih analiz, ki omogočajo napredek pri razumevanju delovanja živih celic, se bliža nova znanstvena revolucija na področju biotehnologije. Danes je možno z novimi generacijami metod sekveniranja določiti zaporedja celotnih genomov. V gostiteljske organizme znamo vstaviti kompleksne heterologne biosintezne in signalne poti. Vendar resničen iziv predstavlja obsežnejše reprogrmiranje genomov, ki bo omogočilo obširnejše prilagoditve industrijskih organizmov za proizvodnjo obnovljivih materialov, biogoriv, zdravil in drugih zapletenih molekul. Kljub temu, da je znanstvenikom že uspelo na novo sintetizirati celoten genom1 je to še vedno izjemno drago in časovno potratno. Izvedljivejša možnost je reprogramiranje obstoječih genomov s pomočjo vstavljanja heterolognih DNA zaporedij. Pred kratkim razviti CRISPR/Cas sistem za z RNA vodeno tarčno specifično uvajanje genomskih prelomov (Priloga, Slika 2) predstavlja preboj na omenjenem področju. Uporabo tega sistema so opisali v več sto znanstvenih člankih objavljenih v najboljših znanstvenih revijah. Medtem ko CRISPR/Cas učinkovito reši problem tarčnega rezanja genoma je sam proces vstavljanja tuje DNA v to mesto še vedno precej neučinkovit. V bakterijskih sistemih se kljub razvoju CRISPR/Cas sistema za modificiranje genomov se vedno najpogosteje uporablja Lambda Red rekombinacija.2 Problem neučinkovitega procesa rekombinacije je tema predlaganega projekta. Predvidevamo, da bomo s pomočjo fizičnega približevanja mutagene DNA in rekombinacijskega sistema k željenemu mestu cepitve v genomu povečali učinkovitost homologne rekombinacije. To nameravamo storiti s pomočjo priprave fuzijskih proteinov med Cas9 endonukleazo in Lambda rekombinacijskega Beta proteina oziroma RecA rekombinaze iz bakterije Escherichia coli (Slika 3). RecA se veže na enoverižno DNA, ki se pojavi okoli mesta poškodbe DNA in tudi medsebojno interagira. RecA povezana na Cas9 bo nase privlekla še večje število RecA proteinov. Podobno tudi Beta protein iz Lambda sistema enoverižno DNA in tudi fuzija Beta proteina s Cas9 bo verjetno privlekla na specifično mesto v genomu še dodatne komponente rekombinacijskega sistema. Predvidevamo da bo rekrutacija rekombinacijskega mehanizma k željenemu mestu v genomu povečala učinkovitost homologne rekombinacije in vstavljanja tuje DNA v to mesto v genomu.
Alternativna možnost, ki jo bomo testirali je, da bomo mutageno DNA približali tarčnemu mestu v genomu s pomočjo podaljševanja 3' konca sgRNA molekule. Omenjen podaljšek bo komplementaren mutageni enoverižni DNA molekuli. Komplementarno parjenje med mutageno DNA in podaljškom sgRNA (Slika 5) bo prav tako omogočilo bolj učinkovito približevanje mutagene DNA k specifičnemu mestu v genomu. Podobno bo TALE DNA vezavni protein dizajniran tako da bo vezal mutageno dvoverižno DNA molekulo in povezan s Cas9, približal mutageno DNA k tarčnemu mestu v genomu (Slika 4). Pričakujemo, da bodo opisani pristopi povečali učinkovitosthomologne rekombinacije, ker bodo povečali efektivno lokalno koncentracijo mutagene DNA v okolici tarčnega mesta v genomu. Razvite metode bomo preizkusili tako v bakterijah kot v sesalskih celicah.
Dodatno nameravamo začasno utišati endogene gene E. coli, ki ovirajo proces rekombinacije. In sicer s pomočjo dizajniranih transkripcijskih faktorjev, kar bo omogočilo učinkovitejše rekombinacijo v divjih sevih bakterije (Slika 1). Testirali bomo učinkovitost vstavljanja različno velikih insertov, tudi več kilobaz in hkratno vstavljanje DNA na več različnih mest v genomu.
Pričakujemo, da bo izboljšano tarčno vstavljanje večjih DNA kosov v vnaprej določene pozicije v genomu predstavljalo izredno učinkovito orodje za preoblikovanje genomov z velikim potencialom za uporabo v biotehnoloških in terapevtskih aplikacijah.
Pomen za razvoj znanosti
Tehnologija CRISPR/Cas kot orodje za genomski inženiring je bila vse od uveljavitve tema več sto znanstvenih publikacij v najboljših znanstvenih revijah (vsaj 20 publikacij v revijah Cell, Science in Nature v obdobju 2013 - 2014), nešteto akademskih in industrijskih raziskovalnih oddelkov pa jo je sprejelo kot razvojno orodje. Pojavila so se tudi števila start-up podjetja, ki pri svojem delu uporabljajo in razvijajo to tehnologijo. Vendar težavo pri tej tehnologiji predstavlja predvsem nezadostna učinkovitost vstavitve izbranega zaporedja DNA v določeno mesto genoma bakterijskih in sesalskih celic. Izboljšanje učinkovitosti homologne rekombinacije z nadaljnjim razvojem sistema CRISPR/Cas, kot je predlagano v tem projektu, bi prineslo nove obete v biotehnologiji, v načrtovanju proizvodnih organizmov v industriji in nove možnosti uporabe v medicini. Vsakršna izboljšava homologne rekombinacije z uporabo sistema CRISPR/Cas bi bila za znanstvenike na tem področju dobrodošla, posebej za aplikacije, pri katerih selekcija oziroma proti selekcija za izbor rekombinant ni mogoča. Ideja, predlagana v tem projektu, je izvirna in še ni bila raziskana. Ta tehnologija bi se lahko uveljavila v številnih vejah biotehnologije in molekularne biologije, za inženiring organizmov kot celičnih tovarn za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, biogoriv, prehranskih dodatkov, biomaterialov ter tudi za inženiring celične logike in v številnih drugih aplikacijah. Pričakujemo tudi objave publikacij v vplivnih znanstvenih revijah.
Pomen za razvoj Slovenije
Tema predlagane raziskave je zelo pomembna za industrijo na področju biotehnologije. V tem projektu je obravnavana poglavitna težava, povezana z usmerjenim genetskih spreminjanjem industrijskih sevov E. coli (težava je razložena v Poglavju 11, rešitev pa je predlagana v Delovnem paketu 1). Pomembno vlogo pri zmanjševanju stroškov v biotehnološki in farmacevtski industriji igra tudi čas, ki je potreben za izvedbo genomskih modifikacij industrijskih sevov. Skrajšanje tega časa lahko doprinese k dobičku in posledično na dolgi rok pripomore k znižanju cen farmacevtskih učinkovin. Ta projekt bi lahko imel koristi tudi v akademskih raziskavah, saj bi s tem pridobili bolj učinkovite metode za spreminjanje prokariontskih in evkariontskih genomov. Spreminjanje genoma navadno terja veliko časa zaradi tehničnih težav v raziskovalnem procesu, zato bi skrajšanje tega časa omogočilo raziskovalcem večjo osredotočenost na cilj njihove raziskave. To bi pripomoglo k večjem številu znanstvenih odkritij, kar dolgoročno vodi k večji blaginji družbe. Kljub temu da gre za temeljni raziskovalni projekt, so mogoči tudi rezultati z vrednostjo intelektualne lastnine. Glede na dejstvo, da ima vodja projekta dve leti izkušenj na področju sodelovanja industrije in znanosti (opisano v Poglavju 9.3) obstaja tudi možnost, da bo potencialna intelektualna lastnina, nastala v tem projektu, integrirana v obstoječo industrijo ali pa bo to osnova za spin-off podjetje, ki se bo ukvarjalo s pripravo specifičnih sevov različnih vrst.
