Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Kontinuirna kromatografska izolacija izooblik monoklonskih protiteles

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
4.06.06  Biotehnika  Biotehnologija  Zaključni procesi v biotehnologiji 

Koda Veda Področje
T490  Tehnološke vede  Biotehnologija 

Koda Veda Področje
2.09  Tehniške in tehnološke vede  Industrijska biotehnologija 
Ključne besede
kontinuirna kromatografija, ločba izooblik MAbsov, induciran pH gradient, graftirani monoliti s hierarhično organiziranimi funkcionalnimi skupinami
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (16)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  26055  dr. Gorazd Hribar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2016 - 2019  49 
2.  30700  dr. Rosana Hudej  Biotehnologija  Raziskovalec  2018 - 2019  26 
3.  33406  dr. Nikolaja Janež  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2016 - 2018  77 
4.  34586  dr. Luka Jeromel  Fizika  Raziskovalec  2017 - 2019  48 
5.  16171  dr. Simona Jevševar  Biotehnologija  Raziskovalec  2016 - 2019  51 
6.  30674  dr. Menči Kunstelj  Farmacija  Raziskovalec  2016 - 2019  18 
7.  39257  Tanja Lukan  Kemija  Tehnični sodelavec  2017 - 2018  16 
8.  27882  dr. Miha Lukšič  Kemija  Raziskovalec  2016 - 2019  211 
9.  16327  dr. Matjaž Peterka  Biotehnologija  Raziskovalec  2016 - 2019  218 
10.  12728  dr. Aleš Podgornik  Kemijsko inženirstvo  Vodja  2016 - 2019  706 
11.  20681  dr. Barbara Podobnik  Farmacija  Raziskovalec  2016 - 2019  62 
12.  35857  Edo Prašnikar  Kemijsko inženirstvo  Raziskovalec  2016 - 2017 
13.  30336  dr. Bojan Šarac  Kemija  Raziskovalec  2016 - 2019  102 
14.  39357  Helena Trnovec  Farmacija  Raziskovalec  2017 - 2019 
15.  37945  Jasmina Tušar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2016 - 2019 
16.  36120  Eva Zaletel  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2019  16 
Organizacije (3)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0103  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo  Ljubljana  1626990  23.093 
2.  0258  Lek farmacevtska družba d.d.  Ljubljana  1732811  9.385 
3.  3030  Center odličnosti za biosenzoriko, instrumentacijo in procesno kontrolo  Ajdovščina  3660460  935 
Povzetek
Monoklonska protitelesa (mAbs) predstavljajo danes najpomembnejša biološka zdravila, ki omogočajo zdravljenje mnogih težko ozdravljivih bolezni, kot je npr. Rak. mAbs so proteini velikosti okrog 150 kDa, njihova biološka funkcija pa je definirana s postranslacijskimi modifikacijami. Zaradi tega lahko isto protitelo nastopa v več tisoč oblikah, izolirati pa je potrebno samo ciljno obliko, kar znatno poveča kompleksnost izolacije. Tipično se za to uporabljajo kromatografske kolone z dokaj položnimi gradienti spiranja, ki podražijo izolacijo na preparativnem nivoju.   Eden izmed možnih načinov znižanja proizvodnih stroškov je prehod iz šaržnega na kontinuiren način izolacije, kar tipično zmanjša volumen kromatografskih kolon a znatno poveča kompleksnost sistema. Način, ki se pogosto uporablja, je t.i. simuliran gibljivi sloj (ang. simulated moving bed – SMB), kjer s preklapljanjem ventilov simuliramo gibanje stacionarne faze. Tak sistem se uporablja pri ločevanju kiralnih komponent, pri katerih ločba poteka pri konstantni sestavi mobilne faze, torej brez gradientov. Šele v zadnjem času so bili razviti kompleksni kontinuirni kromatografski sistemi (ang. MCSGP), ki omogočajo vzpostavljanje gradientov, ki pa so pretežno še vedno v fazi razvoja   Najnovejše raziskave na področju ionsko-izmenjevalnih (IEX) kromatografskih nosilcev so pokazale, da se lahko ponovljiv položen pH gradient generira kot posledica titracije IEX skupin na nosilcu pri stopenjski spremembi ionske moči mobilne faze. To odpira možnost uporabe dokaj preproste verzije kontinuirnega sistema za izolacije različnih izooblik mAbs.   Projekt je razdeljen v štiri glavne sklope. Prvi sklop je postavitev cikličnega kontinuirnega kromatografskega sistema, ki je v osnovi podoben MCSGP sistemu, le da je bistveno preprostejši, saj ni potrebe, po tvorbi gradienta mobilne faze s črpalko. V osnovi bo sistem sestavljen iz dveh kolon enakega tipa pri čemer bomo vzorec izmenjaje nalagali na eni koloni, na tisti, kjer ne bo nalaganja, pa bomo izvajali ločbo izooblik z induciranim pH gradientom in recklirali nečiste frakcije s produktom. Testirali bomo njegovo robustnost in ponovljivost.   Drugi sklop bo razvoj kromatografskih kolon, ki bodo vsebovale šibke in močne IEX skupine. Za učinkovito izrabo induciranega pH gradienta v preparativne namene potrebujemo močne IEX skupine za vezavo protitelesa in šibke IEX skupine, ki niso dostopne protitelesu in ustvarjajo robusten pH gradient. Izvedli bomo eksperimente z različnimi razmerji šibkih in močnih IEX skupin ter s tem za konkreten tip mAbs-ov ustvarili optimalni induciran pH gradient ter kapaciteto.   Tretji sklop bo razvoj graftiranih monolitnih nosilcev s šibkimi in močnimi IEX skupinami. Prednost uporabe monolitov je v tem, da imajo tokovno neodvisne lastnosti kar omogoča delovanje pri visokih linearnih hitrostih torej posledično večjem številu ciklov na časovno enoto. Pripravili bomo grafitrane monolite tako, da bomo na površino por monolita vnesli šibke IEX skupine ter nato graftirali polimerne verige z  z močnimi IEX skupinami. Pri dovolj visoki gostoti se linearne verige postavijo pravokotno na podlago zaradi odbojnih sil med močnimi IEX skupinami. Ker dostopajo protitelesa iz mobilne faze v pori na površino nosilca, se adsorbirajo na močne IEX skupine preden pridejo do šibkih, zato ne vplivajo na induciran pH gradient. Lastnosti takega monolitnega nosilca spreminjamo z deležem šibkih IEX skupin, ki jih pretvorimo v polimerne verige, kot tudi z dolžino teh verig.   Četrti sklop predstavlja razvoj procesa izolacije mAbs na osnovi kontinuirne kromatografije in induciranega pH gradienta. Uporabili bomo oba tipa prej optimiranih kromatografskih nosilcev. Nalagali bomo realne vzorce in optimirali tako kolone kot delovanje sistema, izvajali ustrezno analitiko kvalitete in čistosti produkta ter definirali optimalne protokole.
Pomen za razvoj znanosti
Tekom projekta pričakujemo pridobitev mnogih novih spoznanj, ki bodo pomembna na več področjih znanosti. Razvoj kontinuirnega kromatografskega sistema za ločevanje bioloških makromolekul brez gradientnih črpalk predstavlja novost v svetovnem merilu, ki bo lahko znatno doprinesla v optimizaciji različnih zaključnih procesov. Ker uporabe induciranega pH gradienta do sedaj v kontinuirnih sistemih še ni bilo, bi ob njegovi uspešni uporabi za izolacijo izooblik monoklonskih protiteles pričakovali njegovo aplikacijo na druge sisteme kot so npr. PEGilirani proteini, različne izoencimske oblike, itd. Enostavno pridobivanje večjih količin navedenih molekul pa seveda poceni študij njihovih lastnosti kot tudi področje uporabe in s tem tudi hitrejše pridobivanje novih spoznanj. Drugi pomemben segment doprinosa znanosti je priprava nosilcev s hierarhično organiziranimi funkcionalnimi skupinami. Gre za popolnoma novo področje, ki takorekoč še ni raziskano in lahko pripelje do novih separacijskih mehanizmov in posledično selektivnosti pri ločbi. Doprinos predvidevamo pri načinih sinteze tovrstnih nosilcev, ki bi lahko bili kasneje preneseni tudi na delčne nosilce, predvsem pa pri študiju adsorpcijskih mehanizmov na takih nosilcih. Vpliv porazdelitve skupin na adsorbcijske lastnosti je praktično neraziskano področje, ki lahko pripelje do nove generacije kromatografskih nosilcev z večjo učinkovitostjo.
Pomen za razvoj Slovenije
Biološka zdravila, katerih največjo skupino predstavljajo prav monoklonska protitelesa (mAbs) predstavljajo danes velik del farmacevtskega trga. Ker se življenjska doba v razvitem svetu podaljšuje in se prebivalstvo stara, incidenca autoimunskih bolezni ter rakavih obolenj stalno narašča. Zaradi velikih odmerkov in dolgotrajnosti terapij je zdravljenje zelo drago in vse, tudi najbolj razvite države na svetu, se danes soočajo s problemi izredno dragega oziroma predragega zdravstva. Naši pristopi bi lahko vodili do cenovno dostopnejših biofarmacevtikov, ki bi bili na voljo najširši populaciji, in bi tako prispevali k izboljšanju zdravstvenega stanja in kvalitete življenja. Če povzamemo, bi lahko pristopi razviti v okviru tega projekta vodili do: - širše dostopnosti pacientov do visoko učinkovitih bioloških zdravil - zmanjšano breme za zdravstveni sistem - bolj učinkovit, kot tudi bolj trajnosten produkcijski proces Prav tako bo projekt, katerega namen je ustvarjanje novih in revolucionarnih tehnologij, omogočil dvig konkurenčnosti in rast podjetij vključenih ter ustvarjanje novih delovnih mest z visoko dodano vrednostjo.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Vmesno poročilo, zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Vmesno poročilo, zaključno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno