Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

"DNA sampling II": Metoda za prepoznavo na DNA neposredno ali posredno vezanih proteinov v bakteriji

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
1.05.00  Naravoslovje  Biokemija in molekularna biologija   

Koda Veda Področje
P320  Naravoslovno-matematične vede  Nukleinske kisline, sinteza beljakovin 

Koda Veda Področje
1.06  Naravoslovne vede  Biologija 
Ključne besede
Bakterija Patogena bakterija, Infekcija, Uravnavanje prepisa genov, Prepis genov, Transkripcijski faktor, Antibiotik, Vzorčenje DNA
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (20)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  16104  dr. Apolonija Bedina Zavec  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2020  152 
2.  24290  dr. Matej Butala  Biokemija in molekularna biologija  Vodja  2017 - 2020  236 
3.  23399  dr. Tomaž Curk  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2017 - 2020  253 
4.  25974  dr. Cene Gostinčar  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2020  330 
5.  32099  dr. Maja Grundner  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  34 
6.  53283  Maja Hostnik  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2020  18 
7.  52386  Eva Kočar  Biokemija in molekularna biologija  Tehnični sodelavec  2019 - 2020  29 
8.  18749  dr. Rok Kostanjšek  Biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  470 
9.  00412  dr. Igor Križaj  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  725 
10.  53699  Amela Kujović  Biokemija in molekularna biologija  Tehnični sodelavec  2019 - 2020  24 
11.  17276  Jelka Lenarčič    Tehnični sodelavec  2017 - 2020 
12.  18802  dr. Adrijana Leonardi  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  156 
13.  06994  dr. Peter Maček  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2018  523 
14.  35371  dr. Maruša Novak  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2018  34 
15.  35372  dr. Davor Obradović  Naravoslovje  Raziskovalec  2017  14 
16.  51231  dr. Anja Pavlin  Biokemija in molekularna biologija  Mladi raziskovalec  2018 - 2020  26 
17.  12048  dr. Marjetka Podobnik  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  316 
18.  15328  dr. Kristina Sepčić  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  728 
19.  15600  mag. Maja Šimaga    Tehnični sodelavec  2019 - 2020 
20.  06905  dr. Tom Turk  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  619 
Organizacije (4)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0104  Kemijski inštitut  Ljubljana  5051592000  20.916 
2.  0106  Institut "Jožef Stefan"  Ljubljana  5051606000  90.600 
3.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  66.215 
4.  1539  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za računalništvo in informatiko  Ljubljana  1627023  16.226 
Povzetek
Prepis genov se začne z vezavo regulatornih proteinov na tarčna zaporedja na DNA. Sposobnost bakterij, da prilagodijo prepis genov (npr. genov za virulenčne faktorje, za odpornost proti antibiotikom) glede na pogoje v okolju, je ključnega pomena za razvoj njihovega patogenega potenciala. V tem procesu morajo proteini izmed velike večine nespecifičnih motivov na DNA prepoznati tarčna zaporedja. Pogosto se na isto regulatorno regijo veže več transkripcijskih faktorjev, ki se odzovejo na različne signale, in tako omogočijo precizno aktivacijo promotorja. Pomembno za razumevanje procesov v bakterijah je, da bi bila na voljo metoda s katero bi lahko prepoznali kateri transkripcijski faktorji specifično interagirajo z izbranim promotorskim področjem, tako koordinirajo prepis gena v določenih pogojih. To je še posebej pomembno za razumevanje indukcije virulentnih dejavnikov patogenov. Nadalje, sintetiziramo lahko molekule, ki vplivajo na delovanje regualtornega proteina, kar vodi do inhibicije prepis virulenčnih genov v patogenih bakterijah, ne da bi pri tem vplivali na komenzale. Izziv ostaja, da bi izdelali učinkovito metodo s katero bi prepoznali komplekse proteinov vezane na preučevane odseke v genomu bakterij. Izdelali smo protokol »DNA sampling«, ki omogoča hitro izolacijo specifičnega fragmenta DNA v kompleksu s proteini direktno iz bakterije E. coli. Glede an naše znanje je to prvi opisan pristop za identifikacijo bakterijskih protein-DNA kompleksov in vivo. Ugotovili smo pomankljivosti postopka, zato je cilj tega projekta modificirati protokol DNA sampling, da bo učinkovitejši, efektivnejši in cenovno ugodnejši protokol, ki ga bomo lahko aplicirali v različnih bakterijah. Z izboljšano metodo bomo identificirali vse transkripcijske faktorje vezane na področje specifičnih promotorjev laboratorijskega ali enterotoksigenega seva Escherichia coli ali v bakteriji Pseudomonas aeruginosa. Implementirali bomo ali prečno povezovanje nukeloproteinskih kompleksov s formaldehidom ter kasnejšim razklopom prečnih povezav ali pa bomo iz genoma izrezane komplekse ujeli v minicelice. Slednja metoda ne temelji na uporabi kemičnih prečnih povezovalcev, da bi stabilizirali kompleks, zato predstavlja najbližji primer identifikacije proteinov pri pogojih kot so v celici. Z DNA asociirane proteine bomo identificirali z masno spektrometrijo in profil metilacije tarčne DNA prepoznali ob uporabi na metilacijo občutljivih restrikcijskih encimov. Rezultate pridobljene z izboljšanim protokolom bomo validirali in silico, in vitro ter in vivo.
Pomen za razvoj znanosti
Trenutna dogma na področju prepisa genov v bakterijah je, da uravnavanje prepisa genov večinoma poteka s proteini, ki se direktno vežejo na DNA. Znotraj skupine, ki prijavlja ta projekt pa verjamemo, da zapletene kombinacije direktno vezanih transkripijskih faktorjev in na DNA indirektno vezanih proteinov-kofaktorjev uravnavajo aktivnost posameznega promotorja. Na razpolago nimamo efektivnih metod za izolacijo in identifikacijo proteinov vezanih na tarčni odsek DNA direktno iz celic, kar bi omogočilo sledenje spremembi v naboru in koncentraciji teh proteinov tekom časa, pri določenih okoljskih pogojih. Trenutno uporabljamo pristope za afinitetno izolacijo transkripcijskih faktorjev ob uporabi DNA sond s katerimi lovimo te faktorje iz očiščenih celičnih lizatov in tako mimikriramo pogoje kot so v celici. Naš predlagani protokol omogoča prepoznavo osnovnih, do sedaj še nepojasnjenih mehanizmov regulacije prepisa genov direktno v bakterijah. Uspešnost realizacije projekta je zagotovljena saj je osnovana na že validiranem pristopu DNA sampling in ob dejstvu, da izboljšan pristop izkorišča dva različna, a komplementarna načina izolacije nukleoproteinskih kompleksov. S tem ima tak zmogljivejši pristop izjemen potencial za študije izražanja genov v bakterijah (npr. genov za toksine, za odpornost proti antibiotikom) v številnih laboratorijih po svetu, ki se ukvarjajo s takšnimi raziskavami. V principu, se lahko izboljšana metoda, DNA sampling II, uporablja za analizo kateregakoli odseka DNA in jo lahko z manjšimi posodobitvami uporabimo za raziskave v različnih bakterijah. Metoda omogoča najti odgovor na fundamentalno vprašanje o tem kako bakterije zaznajo stres v okolju in uravnajo prepis genov, da bi preživele, npr. tekom terapije z antibiotiki. Metodo lahko sklopimo s komplementarnimi metodami, ki temeljijo na kromatinski imunoprecipitaciji. Nadalje, pri novem pristopu v katerem izkoriščamo minicelice ne uporabimo kemijskih prečnih-povezovalcev in tako izoliramo kompleks iz okolja, kot je v celici. Tak pristop nam bo tudi omogočil, da analiziramo epigenetske lastnosti tarčne DNA. Ob izolaciji nukleoproteinskih kompleksov iz minicelic bi lahko izkoristili elektronsko mikroskopijo, da bi dobili vpogled v arhitekturo transkripcijskega aparata, preučili topologijo DNA in z volumetričnimi meritvami okarakterizirali stehiometrijo proteinov vezanih na tarčno DNA. Ob imobilizaciji kompleksov (RNA-polimeraza – proteini - DNA s promotorjem) na površino čipa za metodo SPR, bi bilo mogoče slediti sprožitvi transkripcije v realnem času, z merjenjem sinteze kratkih transkriptov po dodatku nukleotidov. Razvidno iz naštetega je, da je protokol DNA sampling II pomembno molekularno orodje, ki se ob razvoju občutljivejših metod za vizualizacijo in detekcijo lahko še razvije, tudi v metodo za analize na nivoju genoma.
Pomen za razvoj Slovenije
Vedno pogostejše porajanje odpornosti proti antibiotikom med bakterijami je posledica razširjene uporabe protimikrobnih sredstev za zdravljenje infekcij. Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je nedavno sprožila akcijo za zajezitev širjenja porajanja odpornosti proti antibiotikom: »no action today means no cure tomorrow.« Potrebujemo nove protimikrobne učinkovine, da preprečimo umiranje ljudi zaradi infekcij z bakterijami odpornih proti številnim antibiotikom. V zadnjih desetletjih je bila razvita le peščica novih antibiotikov in ker se odpornost proti antibiotikom med bakterijami naglo širi, se je nabor učinkovitih zdravil v zadnjih letih močno zožal. Inovativni pristopi k zdravljenju infekcij je zapisan v razvojnem programu Evropske unije. Razvojni cilji našega predlaganega projekta so v skladu s smernicami EU, programov FP7 in Obzorje 2020 za raziskave in razvoj pristopov za uničenje bakterij odpornih proti številnim antibiotikom. Rezultati, ki bodo pridobljeni z našim pristopom so komplementarni tudi s programom »innovative Medicines Initiative NewBugs4BadBugs«, povezavo med Evropsko komisijo in farmacevtsko industrijo v Evropi, ki stimulira lansiranje novih antibiotikov na tržišče. S prepoznavo temnih plati regulacije izražanja genov, s prepoznavo zakrite kompleksnosti transkripcijskih faktorjev, ki interagirajo z izbranim lokusom na genomu, lahko pridobimo vpogled v ključne procese patogeneze ali razvoja odpornosti proti antibiotikom. Izboljšani protokol bomo uporabili za analizo delovanja z virulenco povezanih promotorjev enterotoksigene bakterije E. coli, ki je pogost vzrok za smrti med otroci, ter oportunističnega patogena P. aeruginosa, ki je poglavitni vzrok za bolnišnično pridobljeno infekcijo. S protokolom DNA sampling II bomo prepoznali za patogena značilne transkripcijske dejavnike, ki uravnavajo prepis genov vključenih v virulenco. Ti izsledki bodo lahko vodili v razvoj učinkovin naslednje generacije, varnih antibiotikov ali v izdelavo diagnostičnega orodja za hitro detekcijo patogenov. Iz vsega naštetega je razvidno, da je dolgoročni cilj prijavljenega projekta prenos znanja iz akademije v industrijo. Taki načrti so izven dosega te projektne prijave, ki lahko gledano vnaprej privedejo do nastanka javnega-zasebnega partnerstva, patentiranja učinkovin - intelektualne lastne ter lahko vodijo v ustanavljanje odcepljenih (spin-off) podjetij.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Vmesno poročilo, zaključno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno