Loading...
Projekti / Programi vir: ARRS

Razvoj protivnetnih regulatornih celic T (Treg) za terapijo avtoimunske sladkorne bolezni z uporabo načrtovanih transkripcijskih dejavnikov in sistema CRISPR/Cas9

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
3.07.00  Medicina  Metabolne in hormonske motnje   

Koda Veda Področje
B000  Biomedicinske vede   

Koda Veda Področje
3.02  Medicinske in zdravstvene vede  Klinična medicina 
Ključne besede
sladkorna bolezen tipa 1, reprogramiranje regulatornih celic T, Treg; načrtovani transkripcijski regulatorji, CRISPR/Cas9; avtoimunost metode,
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (16)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacij
1.  13023  dr. Tadej Battelino  Medicina  Raziskovalec  2017 - 2020  1.130 
2.  14360  dr. Mojca Benčina  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2020  371 
3.  13409  dr. Nataša Bratina  Reprodukcija človeka  Raziskovalec  2017 - 2020  409 
4.  53354  Petra Dekleva    Tehnični sodelavec  2019 - 2020 
5.  35277  dr. Tina Fink  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2019  21 
6.  34529  dr. Vida Forstnerič  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2018  39 
7.  33868  dr. Urh Grošelj  Reprodukcija človeka  Raziskovalec  2017 - 2020  403 
8.  10412  dr. Simon Horvat  Biotehnika  Vodja projekta/programa  2017 - 2020  520 
9.  06628  dr. Roman Jerala  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  1.116 
10.  34252  dr. Tina Lebar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2017 - 2020  65 
11.  17917  dr. Andreja Majerle  Biotehnologija  Raziskovalec  2017 - 2019  92 
12.  28505  dr. Jernej Ogorevc  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2018 - 2020  119 
13.  24298  dr. Irena Oven  Živalska produkcija in predelava  Raziskovalec  2017 - 2018  81 
14.  50616  Arne Praznik  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2020  31 
15.  38858  Katja Skulj    Tehnični sodelavec  2017 - 2020  13 
16.  20253  dr. Katarina Trebušak Podkrajšek  Reprodukcija človeka  Raziskovalec  2017 - 2018  352 
Organizacije (3)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacij
1.  0104  Kemijski inštitut  Ljubljana  5051592000  20.100 
2.  0312  Univerzitetni klinični center Ljubljana  Ljubljana  5057272000  72.474 
3.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  63.757 
Povzetek
Diabetes mellitus tip 1 (T1D) je kronična metabolna in imunska bolezen. Tipični znak je hiperglikemija, za katero je vzrok nezmožnost izločanja inzulina, saj so uničene beta celice v trebušni slinavki, občutljivost na inzulin ali oboje. Diabetes in zapleti pri diabetesu so postali glavni zdravstveni problem prebivalstva v vseh državah, so vzrok za obolevnost, zgodnjo umrljivost in velika obremenitev za zdravstveni sistem. Čeprav aplikacija inzulina rešuje življenja pacientom z T1D, ta terapija ne zdravi bolezni. Zato so raziskave, ki so usmerjene na razvoj novih pristopov k terapijam, ki bi ozdravile bolezen, zelo upravičene. Ena taka možnost terapije , ki je že v prvi fazi kliničnega testiranja stremi k spremembi ravnotežja od protivnetnih klasičnih T celic (Tconv) k zvišanju števila imuno-zaviralnih regulatornih celic T (Tregs). Vendar, noben tak pristop ali študija še ni privedla do klinične remisije in le malo jih je imelo pomemben učinek na zaustavitev napredovanja T1D. Tukaj predlagamo inovativno strategijo, ki bi privedla do razvoja terapije za T1D, v kateri se združujejo nove tehnologije napredne sintezne biologije ter najsodobnejša znanja imunologije in klinične diabetologije članov projektne skupine. Nedavno odkrit sistem (CRISPR)/Cas9 (angl. clustered regulatory interspaced short palindromic repeat) nudi zelo močno in natančno orodje za genski inženiring, vendar nudi tudi drugo, varno uporabo za regulacijo endogene ekspresije gena. V nasprotju z metodami genske terapije, kjer so možni stranski učinki spreminjanja genoma, je naš predlog osnovan na razvoju načrtovanih transkripcijskih dejavnikov povezave katalitično neaktivne oblike dCAS9 z aktivacijsko domeno (npr. VPR transcriptional activation domain). Narejeni bodo tako, da bodo vzpodbudili ali zavrli transkripcijo tarčnih genov, brez nevarnosti spreminjanja genoma. Predlagamo reprogramiranje Tconv v imuno-zaviralne Tregs z uporabo dCas9-VPR transkripcijskih regulatorjev, ki bodo zvišali raven izražanja glavnih endogenih transkripcijskih faktorjev, ki so podlaga stabilnega, terapevtsko pomembnega Treg fenotipa. Projekt bo vključeval tri glavne stopnje: i) razvoj, selekcijo in potrditev sgRNAs, ki bo zvišala raven transkripcije genov za reprogramiranje Treg, ii) identifikacija učinkovite kombinacije genov, ki reprogramirajo prehod Tconv k Tregs-specifičnemu fenotipu in iii) izolacijo in reprogramiranje Tconv iz krvi pacientov s T1D in njihovo reprogramiranje v terapevtske Tregs. sgRNAs bodo optimizirane za povečano transkripcijo v kombinaciji s dCas9-VPR za vsako od izbranih ~ 10 reprogramiranih transkripcijskih faktorjev  Po optimizaciji zvišanja ravni izražanja transkripcije vsake od TFs, bo določena optimalna kombinacija za pridobitev transkripcijskega profila in ohranitev stabilnega Treg fenotipa, kateri bo končno preizkušen na celicah, izoliranih iz krvi pacienta. Projektna skupina ima znanje in dolgoletne izkušnje z  načrtovanimi transkripcijskimi regulatorji (Gaber et al., Nature Chem. Biol. 2014, Lebar et al., Nature Commun. 2014). Izboljšali smo stopnjo transkripcijske aktivacije za več kot 1000 krat (Lebar et al., ACS SynBio 2016 , tudi vložen patent). Dokazali smo že zvišanje ravni izražanja ekspresije gena pri nekaterih Treg reprogramiranih genih (npr. FoxP3), kot tudi dCas9 transdukcijo in dostavo v človeške celice. Končni cilj projekta je zelo ambiciozen, vendar dosegljiv, osnovan na znanju projektnega tima v imunologiji, metabolizmu, bioinformatiki in sintezni biologiji in spodbujen s preliminarnimi rezultati. Ta predlog je v osnovi pilotna študija za dokaz principa delovanja reprogramiranja Tconv v Treg v celičnih pogojih ter primarnih celicah T pacientov s T1D. Naš pristop se lahko uporabi tudi pri drugih avtoimunih boleznih, ki stremijo k trajni remisiji in vzpostavitvi tolerance na avtoantigene.
Pomen za razvoj znanosti
Napredovanje temeljne raziskave Poglavitna ideja predlaganega projekta je prepoznati tarčne gene in njihove kombinacije za razvoj T-reg indukcijskih proteinov s pomočjo sistema CRISPR/Cas9. Končni cilj je uporabiti to novo razvito osnovno znanje in orodja za pre-programiranje konvencionalnih T-celic, izoliranih izmed celic periferne krvi bolnika s sladkorno boleznijo, v terapevtske regulatorne T-celice. Objavljene študije o diferenciaciji celic T-reg so že izpostavile več genov in spojin, ki inducirajo T-reg-podobno rast in razvoj in vitro ali v živalskih modelih. Kljub temu je seznam potrebnih nadzornih genov za stabilno trans-diferenciacijo običajnih celic T v je T-reg še potrebno dopolniti. V zvezi s tem lahko prispevamo nova osnovna znanstvena spoznanja na tem področju. Naši poskusi bodo tudi zagotovili napredek znanja, kako so imunski sistem in vnetne komponente prepleteni v procesu T-reg trans-diferenciacije in kako to vpliva na razvoj ali zaustavitev avtoimunskega diabetesa. Razvoj novih genskih virov. Pomemben rezultat tega projekta je razvoj novih genskih virov. V skladu s cilji 1-3 bomo razvili DNA konstrukte, ki bodo ciljali več genov, ki sodelujejo v procesu diferenciacije Treg. Ti genskih viri bo narejeni za človeške gene. Koristni bodo tako za preučevanje v okviru predloga projekta, kot tudi v prihodnjih kliničnih študijah naše ali drugih skupin. In vitro in ex vivo viri bodo koristni za različne študije povezane s presnovo in imunskim sistemom, kot je avtoimuni diabetes,širše pa tudi z drugimi avtoimunskimi boleznimi, kjer imajo pomembno vlogo geni, ki jih bomo ciljali v okviru tega projekta (npr. TGF-beta, IL2...). Razvoj novih tehnologij. Čeprav na področju genoma inženiringa v zadnjih letih prevladujejo študije sistema TALE in CRISPR/Cas9, večina študij uporablja to tehnologijo za spreminjanje genoma z namenom izpuščanja, vstavljanja ali zamenjave genskih elementov. Nasprotno se bomo v projektu povsem osredotočili na razvoj novih orodij za uporabo obeh sistemov TALE in CRISPR/Cas9 za urejanje endogene ekspresije genov z njihovim aktiviranjem ali zaviranjem. Kombinirani pristop TALE in CRISPR/dCas9 lahko zagotovi nove in optimirane rešitve za učinkovito regulacijo več endogenih genov s potencialom za različne klinične aplikacije.
Pomen za razvoj Slovenije
Pričakujemo, da bo naša raziskava zagotovila rezultate, ki bodo neposredno pomembni za zdravljenje za uvedbo novega pristopa pri zdravljenju avtoimunske sladkorne bolezni, ki je zdaj prepoznana kot ena od najpogostejših kroničnih bolezni v otroštvu. To lahko privede k zgodnjemu in bolj ciljno usmerjenemu razvoju terapij in posledično k povečanju kakovosti življenja bolnikov, ki so trenutno odvisni od dnevnega prejemanja inzulina. Pričakujemo, da bo naša ex vivo študija na krvnih celicah sladkornih bolnikov prinesla pomembne nove vpoglede v možnosti povečanja zaloge terapevtskih Treg celic z možnimi posledicami za razvoj novih načinov zdravljenja v prihodnosti. Naša študija bo omogočila osnovo za sodelovanje s farmacevtskimi podjetji za razvoj protokolov reprogramiranja običajnih T celic pacientov v stabilne in dolgožive terapevtske celice Treg.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Vmesno poročilo, zaključno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno