Projekti / Programi
Ugotavljanje in karakterizacija povzročiteljev kužnih bolezni z metodo naslednje generacije sekvenciranja
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.04.00 |
Biotehnika |
Veterina |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.03 |
Kmetijske vede in veterina |
Veterina |
naslednja generacija sekvenciranja, metagenom, celotni genom, obdelava vzorcev, virusi, bakterje
Raziskovalci (30)
Organizacije (3)
Povzetek
Klasične mikrobiološke preiskave, ki se rutinsko uporabljajo v kliničnih laboratorijih za identifikacijo in karakterizacijo patogenov, imajo več pomembnih omejitev, saj temeljijo na sposobnosti gojenja mikroorganizmov v laboratorijskih pogojih. Poleg tega so časovno potratne in omejene na manjše število izbranih tarčnih vrst, zato ostale patogene, ki so lahko tudi prisotni, s temi metodami spregledamo. Molekularne metode predstavljajo pomemben napredek v diagnostiki kužnih bolezni in ne zahtevajo predhodne namnožitve patogenov, vendar so večinoma uporabne le za določanje že znanih patogenov. Hitre in zanesljive metode za ugotavljanje različnih patogenov so pomembne za preprečevanje njihovega širjenja in za nadzor nad boleznimi, kar je nujno za preprečevanje velikih gospodarsko-ekonomskih škod ter za zagotavljanje zdravja živali in ljudi.
Pomemben preskok v diagnostiki kužnih bolezni predstavlja sekvenciranje naslednje generacije (NGS), ki je prišlo na tržišče leta 2005. Illumina in Ion Torrent sta trenutno vodilni tehnologiji. Pri NGS za razliko od sekvenciranja po Sangerju hkrati sekvenciramo veliko število kratkih zaporedij, ki jih sestavimo v daljša na podlagi njihovega medsebojnega prekrivanja. Prvi sklop aplikacij NGS v mikrobiologiji vključuje neposredno in naključno sekvenciranje celotne DNA oziroma cDNA v izbranih vzorcih (metagenomski pristop). Na ta način lahko odkrivamo nove patogene in mešane okužbe. Drugi sklop aplikacij NGS zajema tipizacijo mikrobnih izolatov in ugotavljanje različnih genetskih determinant, na podlagi katerih lahko proučujemo tudi evolucijo in poti širjenja patogenov.
Z metagenomskim pristopom bomo ugotavljali prisotnost posameznih ali več patogenov v vzorcih, hkrati pa bomo v vzorcih v primeru bolezni virusne etiologije določali tudi zaporedja celotnih virusnih genomov za namen ugotavljanja genetskih značilnosti oz. posebnosti v povezavi s klinično sliko bolezni. Pri bakterijah bomo ugotavljali determinante virulence, odpornosti proti protimikrobnim zdravilom ter ugotavljali morebitno vlogo živalskih in okoljskih izolatov za okužbe ljudi. Na podlagi zaporedij celotnih genomov jih bomo filogenetsko analizirali in tipizirali. V raziskavo bomo vključili vzorce klinično obolelih živali z znaki črevesnih ali respiratornih obolenj, saj so njihovi povzročitelji najpogostejši vzrok kužnih obolenj pri ljudeh in živalih v svetovnem merilu. Vključili bomo tudi vzorce poginulih in obolelih živali z neznano etiologijo bolezni s hujšo klinično sliko. Med patogenimi bakterijami se bomo osredotočili na proti meticilinu odporni vrsti Staphylococcus aureus (MRSA) in Staphylococcus pseudintermedius (MRSP), ki postajata vse bolj pereč problem v humani in veterinarski medicini. Proučevali bomo tudi bakterije Clostridium difficile, ker se izolati, ki so bili v preteklosti povezani z živalskimi gostitelji, vse bolj pojavljajo pri ljudeh. Pri virusnih okužbah se bomo osredotočili na terenske izolate različnih vrst virusov, ki smo jih pridobili iz klinično obolelih živali. V projekt bomo vključili ekonomsko pomembne viruse, kot sta virus prašičjega reprodukcijskega in respiratornega sindroma (PRRS) in virus goveje virusne diareje (BVD), kar je pomembno za razjasnitev njihove epidemiologije in za nadzor bolezni. Vključili bomo tudi virus modrikastega jezika (BTV) in viruse stekline ter novo porajajoče enterične viruse.
Glavni namen projekta je dopolnitev in širitev že obstoječih metod z novo tehnologijo NGS, s katero želimo najprej razviti, optimizirati in uvesti postopke NGS za potrebe hitrega ugotavljanja patogenov v različnih kliničnih vzorcih z metagenomskim pristopom. Določali bomo tudi zaporedja celotnih virusnih in bakterijskih genomov, ugotavljali pomen genetskih značilnosti pri nastanku kliničnih znakov bolezni ter epidemiološko povezavo med sevi posameznih patogenov. V okviru projekta bo tako poleg uspešne priprave vzorcev za sekvenciranje NGS glavni izziv tudi bioinformacijska analiza pridobljenih poda
Pomen za razvoj znanosti
Raziskovalni partnerji (institucije znanja) želijo povečati področje aplikativnih raziskav, si zagotoviti dolgoročno sofinanciranje dejavnosti s strani gospodarskih družb ter se pripraviti na konkurenčen nastop pri pridobivanju evropskih in drugih mednarodnih projektov. Temeljni in izvirni znanstveni prispevki, pridobljeni v okviru projekta, bodo predstavljeni tako nacionalni kot tudi mednarodni strokovni in znanstveni javnosti. Projektna skupina načrtuje objavo vsaj treh znanstvenih člankov v revijah z visokimi faktorji vpliva, prav tako bodo vsi genomi poslani v gensko banko in tako dostopni raziskovalcem po svetu. Omeniti je potrebno še, da je tematika projekta v celoti skladna s prioritetami nacionalnega raziskovalnega programa Republike Slovenije, kjer so perspektivna področja za Slovenijo definirana kot tista, ki omogočajo poglobitev znanja, znanstvene prepoznavnosti in gospodarske učinkovitosti. Raziskava je prav tako v skladu s prioritetami 3. stebra slovenske tehnološke platforme Hrana za življenje. Poleg tega tudi program H2020 vključuje področje zdravja, ki je tesno povezan z zdravo hrano. Z vpeljavo nove metodologije v našem projektnem delu vidimo možnost sodelovanja v projektnem konzorciju, ki bo proučeval hrano in zdravje.
Raziskave v okviru tega projekta bodo privedle do novih odkritij predvsem genetskih karakterizacij celotnih genomov patogenov, ki so stalno ali občasno prisotni na našem območju in jih bo mogoče primerjati s podatki v mednarodnem prostoru. Razumevanje odnosov med kužnimi povzročitelji in njihovimi gostitelji bo dodatno prispevalo pri oblikovanju prihodnjih smernic za varovanje zdravja tako živali kot ljudi. Rezultati bodo omogočili tudi kritično ovrednotenje že uveljavljenih genotipizacijskih metod. Z razvojem novih metod za dokazovanje povzročiteljev bolezni bomo pomembno prispevali k izboljšanju diagnostičnih postopkov in primerljivosti naših rezultatov na mednarodni ravni.
Delo na projektu bo tako prispevek k mednarodni izmenjavi znanja in promociji slovenske znanosti. Nova spoznanja bomo neposredno sproti vključevali v prakso in tudi v pedagoško in raziskovalno delo študentov veterine, medicine, mikrobiologije in drugih sorodnih smeri.
Pomen za razvoj Slovenije
Hitre in zanesljive metode za ugotavljanje različnih patogenov, za epidemiološke študije in za nadzor nad boleznimi so nujne za zagotavljanje zdravja živali in ljudi. Nova diagnostična orodja bodo omogočila učinkovitejšo in hitrejšo diagnostiko povzročiteljev izredno nevarnih kužnih bolezni in drugih pomembnih bolezni pri živalih ter ljudeh, hkrati pa bodo podlaga za ukrepe za nadzor bolezni, kar bo privedlo do zmanjšanja izgub pri živalih in tveganja za okužbo ljudi.
Nova spoznanja o medsebojni prepletenosti odnosov različnih patogenih in potencialno patogenih mikroorganizmov pri živalih ter odkrivanje novih patogenih povzročiteljev bodo podlaga za načrtovanje učinkovitejših ukrepov za preprečevanje respiratornih in črevesnih bolezenskih stanj, ki predvsem v intenzivnih rejah gospodarskih živali, privedejo do največjih ekonomskih izgub. Nova znanja bodo pomagala izboljšati rejo živali, omejila zdravstvene probleme, izboljšala možnosti izbire pravilne terapije, poskrbela za čistejše okolje ter prispevala k pridelavi cenejše in varnejše hrane. Dodatno lahko pričakujemo pozitiven učinek projekta na mednarodno konkurenčnost naše živinorejske proizvodnje. V primeru pojava posebno nevarne virusne kužne bolezni bomo z uvedeno tehnologijo lahko hitro izvedli karakterizacijo celotnega genoma povzročitelja, kar postaja že tudi obveza referenčnih laboratorijev. Omejitev širjenja in izbruhov okužb pri živalih bo vplivala na ekonomičnost pridelave hrane in večjo mednarodno konkurenčnost slovenske živinoreje, ki je še zlasti v zadnjih letih pod velikim pritiskom.
Pojav posebno odpornih bakterijskih sevov kot sta MRSA in C. difficile pri živalih je pomemben s stališča zdravja živali, še bolj pa zaradi varovanja zdravja ljudi. Na podlagi karakterizacije in genotipizacije sevov bo mogoče načrtovati in izvesti učinkovite epizootiološke ukrepe za nadzor bolezni, kar bo privedlo do zmanjšanja izgub pri živalih in tveganja za okužbo ljudi. Okužbe ljudi z bakterijama MRSA in C. difficile predstavljajo relativno veliko obremenitev za slovenski zdravstveni sistem. Raziskave mehanizmov odpornosti proti protimikrobnim zdravilom in determinant patogenosti bodo zanimive za širšo veterinarsko in medicinsko stroko, še zlasti pa za Upravo RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin in za medresorsko Komisijo za preudarno rabo protimikrobnih zdravil pri Ministrstvu za zdravje. Služili bodo lahko kot podlaga za izdelavo smernic za racionalno uporabo protimikrobnih zdravil v intenzivnih rejah živali.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
