Projekti / Programi
Modulacija encimskega kompleksa poliketid sintaze v zgodnjih in poznih stopnjah biosinteze tetraciklinskih antibiotikov
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.04 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
Mikrobna biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
antibiotik, tetraciklin, poliketid sintaza tipa 2, Streptomyces, biosintezno inženirstvo,
Raziskovalci (17)
Organizacije (3)
Povzetek
V zadnjih desetletjih se je odpornost patogenov na gotovo vse antibiotike zelo razširila. Tudi tetraciklinski (TC) antibiotiki, ki so bili nekoč zelo učinkoviti, danes pogosto več ne delujejo. Čeprav se je odpornost na TC antibiotike zelo razširila že v 80h letih prejšnjega stoletja, je bil prvi novi antibiotik tigeciklin, t.i. TC antibiotik tretje generacije vpeljan v klinično uporabo šele leta 2006. Danes je torej potreba po razvoju popolnoma novih protibakterijskih učinkovin, ki delujejo proti večkratno-odpornim patogenom iz skupine ESKAPE res urgentna.
Negleda na dejstvo, da smo v zadnjih štirih desetletjih bistveno poglobili naše razumevanje biosinteze TC, nismo uspeli v zadnjih 50 letih vpeljati v kliniko niti en naravni tetraciklinski antibiotik. Raziskovalci ameriskega podjetja Ledele so razvili zadnji naravni TC antibiotic, pomemben intermediate C6-demetil-C7-klortetraciklin, ki ga uporabljamo za pripravo polsinteznih TC antibiotikov druge generacije v 60h letih prejšnjega stoletja. Ta intermediat se še danes proizvaja industrijsko s pomočjo bakterije Streptomyces aureofaciens. Težko je razložiti, kaj so poglavitni razlogi za neuspeh. Verjetno so relativno kompleksni in dolgotrajni postopki molekulrano-bioloških manipulacij aktinomicet en od pomembnih dejavnikov. Z manipulacijo encimskih kompleksov poliketid sintaz (PKS) tipa-I, kot so naprimer encimski kompleksi za biosintezo makrolidov (npr. eritromicina), smo uspeli v zadnjih dveh desetletjih razviti številne analoge s pomočjo pristopov biosinteznega inženirstva. Na žalost pa je slabo razumevanje biosinteznih mehanizmov PKS tipa-II, tako imenovanih reiterativnih (ponavljajočih se) PKS sistemov, ki katalizirajo biosintezo tetraciklinov, verjetno en poglavitnih razlogov za slabo produktivnosti pri razvoju TC analogov.
V našem laboratoriju smo nedavno demonstirali, da je z inovativnimi pristopi biosinteznega inženirstva PKS encimov tipa-II le mogoče razviti nove TC analoge z visoko protibakterijsko aktivnostjo proti po Gramu-negativnim patogenom. V zadnjih petih letih so se zaradi razvoja učinkovitih postopkov genskih manipulacij in hitrega razvoja tehnologij sekvenciranja DNA, ki sedaj prinaša izjemno količino uporabnih informacij o biosintezi teh metabolitov odprle popolnoma nove možnosti za razvoj »inovativnih« antibiotikov, kar želimo izkoristiti prav pri razvoju novih TC analogov v okviru predlaganega projekta.
V obsegu predlaganega projekta bomo izkoristili relativno majhne, vendar izjemno pomebne razlike v substratni specifičnosti različnih PKS kompleksov tipa-II, ki smo jih odkrili v preteklih letih prav v obsegu lastnih raziskav. Gre za encimske komplekse PKS, ki kodirajo biosintezo TC antibiotikov oksitetraciklina, klortetraciklina in nenavadnega TC antibiotika kelokardina, ki jih proizvajajo bakterije Streptomyces rimosus, Steptomyces aureofaciens and Amycolatopsis sulphurea. V obsegu tega projekta nameravamo s pomočjo primerjalnih metod »in vivo« in »in vitro« proučevati začetne stopnje biosinteze TC antibiotikov. S pristopi biosinteznega inženirstva bomo poskusili ugotoviti, na kakšen način t.i. minimalni kompleks PKS izbira začetno gradbeno enoto v procesu biosinteze TC, kot tudi pozne stopnje v biosintezi TC. Prav PKS kompleksi, ki kodirajo biosintezo oksitetraciklina, klortetraciklina in kelokardina omogočajo nove pristope v raziskovanju načina delovanje encimskih kompleksov, ki katalizirajo biosintezo teh medicinsko pomembnih učinkovin. Pričakujemo tudi, da bomo z uporabo lastnih pristopov uspeli proizvesti popolnoma nove tetraciklinske analoge.
Čeprav je poglaviten namen predlaganega projekta prav razumevanje biosinteznih mehanizmov klinično pomembnih TC antibiotikov, pa bojo nova znanja uporabna tudi v manipulacije vse drugih PKS sistemov tipa-II. Zato predvidevamo, da bojo imeli razultati te študije razen znanstvenega prispevka, tudi veliko uporabno vrednost pri razvoju novih TC analogov in pomemben doprinos pri razvoju novih industrijskih bio
Pomen za razvoj znanosti
Sekundarni metaboliti iz skupine poliketidov danes predstavljajo eno najpomembnejših skupin naravnih produktov, ki imajo izjemno raznolike biološke aktivnosti in so uporabni na vseh področjih medicine in kmetijstva. Zato ni presenetljiv velik interes raziskovalnih inštitucij in industrije za to področje raziskovanja. Na primer, Lek/Sandoz kot partner v tem predlogu projekta industrijsko proizvaja poliketidna metabolita, kot sta protirakasta učinkovina rapamicin in pomembeno imunosupresivno učinkovina FK506. Vendar ne le Lek/Sandoz, temveč tudi druga podjetja v Sloveniji, kot je Krka, tržijo naravne poliketidne produkte, ali razvijajo tehnologije za svoje naročnike (Acies Bio Ltd.). V okviru predlaganega projekta bomo raziskave usmerili predvsem v študij kompleksnih encimskih mehanizmov, encimskega kompleksa poliketid sintaze (PKS) tipa-II, ki katalizira biosintezo pomembnih sekundarnih metabolitov, kot so tetraciklinski (TC) antibiotiki in protirakaste učinkovine iz skupine antraciklinov. V primerjavi z dobro poznanimi PKS tipom-I, ki kodirajo biosintezo številnih pomembnih učinkovin, kot sta antibiotik eritromicin ali protirakasto zdravilo rapamicin, je regulacija encimskih kompleksov PKS tipa-II še vedno slabo poznana. Zato je nujno pridobiti globje razumevanje katalitičnih mehanizmov ponavljajočega-tipa encimov PKS tipa-I. Zaradi reiterativne (ponavljajoče se) narave delovanja tako imenovanih minimalnih kompleksov PKS tipa-II, ki so vključeni v začetne stopnje biosinteze TC, še vedno ne razumemo dovolj dobro biosinteznih mehanizmov teh kompleksnih encimov. To je verjetno tudi eden izmed poglavitnih razlogov, da tega znanja ne moremo učinkovito uporabiti za generiranje novih TC analogov z uporabo biosinteznega inženiringa.
Nedavno smo demonstirali, da je uporaba biosinteznega inženiringa pri PKS tipu-II lahko produktivna (Lešnik, Lukežič et al., 2015, Angew Chem Int Ed Engl. 2015 54(13):3937-40). Zaradi hitrega razvoja na področju biosinteznega inženiringa in sintezne biologije, katerih orodja so postala cenovno dostopna in učinkovita, ter zaradi ogromnih in hitro naraščajočih količin genomskih podatkov v podatkovnih zbirkah DNA, so se prav gotovo pojavile nove priložnosti pri razvoju TC zdravil. Zato verjamemo, da bomo v sklopu projekta z uporabo unikatnega pristopa biosinteznega inženiringu, in z »in vivo« testi na osnovi konstruiranih himernih konstruktov kompleksa PKS tipa-II lahko pridobili ključne podatke o biosinteznem programu tega kompleksnega encimskega sistema. Poleg tega načrtujemo evalvacijo katalitične aktivnosti in substratne specifičnosti encimskega sistema za biosintezo OTC »in vitro«, kar do danes še ni bilo preučeno. Naše aktivnosti v obsegu predvidenega projekta zato ne bojo doprinesle le razvoju kakovostne znanosti, temveč tudi k hitrem prenosu tega znanja iz akademije v industrijsko okolje.
Pomen za razvoj Slovenije
Poliketidni sekundarni metaboliti predstavljajo danes eno največjih skupin medicinsko in kmetijsko pomembnih učinkovin z ocenjenim svetovnim prihodkom več kot 50 milijard dolarjev letno. Tako ne preseneča dejstvo, da je veliko truda vloženega v preučevanje biosinteze teh pomembnih metabolitov, ki izkazujejo širok spekter aktivnosti kot so protibakterijske, protirakaste, protiparazitske, aktivnost pri zniževanju holesterola, imunosupresivna aktivnost in mnoge druge. Na splošno predstavlja uporaba sekundarnih metabolitov velik pomen za sodobno družbo kot tudi za biotehnološko, kemijsko in farmacevtsko industrijo. Glede zagotovljanje napredka pri razvoju novih zdravil, naprednih in okolju prijaznih bioprocesov obstaja velika potreba po študiju biosinteze teh naravnih proizvodov.
V okviru obstoječega projektnega predloga sodelujemo neposredno z raziskovalci podjetja Lek/Sandoz, s katerimi bomo s pomočjo naprednih tehnologij biosinteznega inženiringa, kemobiosinteze in biotransformacije poskusili razviti nove bioprocese. V sodelovanju z Lek/Sandoz in njihovim prispevkom na področju raziskovanja ter razvoja se bomo najbolj osredotočili na halogenacijske reakcije v smeri razvoja tehnologij za okolju prijazno in ekonomsko izboljšano proizvodnjo pomembnih generičnih proizvodov, ki jih Lek/Sandoz že trži. Zelo plodno sodelovanje Biotehniške fakultete (prof. Petković) in Inštituta Jožef Štefan (prof. Stavber) s slovensko industrijo LEK/Sandoz, Krka, Acies Bio, Medis, TKI Hrastnik itd.) je bilo izkazano že v preteklosti. Njegov rezultat je bil razvoj novih tehnologij z visoko dodano vrednostjo intelektualne lastnine (US 8980585B2, US8361777B, EP2019869B1). Prav tako je pomembno poudariti, da smo v preteklosti kot plod našega truda ustanovili spin-off podjetje Acies Bio d.o.o. Ljubljana, ki trenutno zaposluje preko 35 raziskovalcev in uspešno razvija nove bioprocese že 10 let.
Po drugi strain, pa se naš predlog projekta nanaša tudi na velik problem razširjene odpornosti kliničnih patogenov na antibiotike, ki jih uporabljamo za zdravljenje infekcij. Še posebno se to nanaša na bolnišnične infekcije, ki jih jih povzročajo večkratno-odporni patogeni iz skupine ESKAPE. Pričakujemo, da bojo naši napori rezultirali v razvoju popolnoma novih tetraciklinskih matric, ki bojo uspešno komplementirali nadeljne razvojne stopnje polsintezne kemije, pa tudi ostale, po biosintezi podobne skupine medicinsko pomembnih antibiotikov poliketidnega izvora. Če povzamemo, razen kakovostega znanstvenega prispevka, bojo predvidoma rezultati tega projekta imeli pozitive vpliv na razvoj novih tehnologij, ki bojo takoj prenoslijeve v industrijsko okolje. Neposredni rezultat našega dela bojo predvidoma novi tetraciklinski analogi. Ob tem pa se bomo angažirali tudi v razvoj novih bioprocesov v sodelovanje z raziskovalci Lek/Sandoza.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
