Projekti / Programi
Razvoj encimskega preparata za dezinfekcijo s prioni kontaminiranih površin.
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.06 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
Zaključni procesi v biotehnologiji |
| Koda |
Veda |
Področje |
| B510 |
Biomedicinske vede |
Infekcije |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.09 |
Tehniške in tehnološke vede |
Industrijska biotehnologija |
dezinfekcija prionov, termostabilne proteinaze, pernizin, heterologni ekspresijski sistem, Streptomycies sp.
Raziskovalci (18)
Organizacije (3)
Povzetek
Prenosljive spongiformne encefalopatije (TSE) predstavljajo družino nevrodegenerativnih bolezni živali in ljudi. Pojav humane variante v novi obliki Creutzfeldt-Jakobove bolezni (vCJB), ki je posledica epidemije goveje spongiformne encefalopatije (BSE) v Veliki Britaniji, je povečal prepoznavnost prenosljive spongiformne encefalopatije kot resno tveganja za javno zdravje po svetu. CJD je smrtna nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene v povprečju eno osebo na milijon prebivalcev na leto v Združenih državah Amerike. Infektivni prioni, ki povzročajo CJD ali druge TSE kažejo visoko odpornost na običajne kemijske in fizične metode dekontaminacije. Prioni so poznani po tem, da se dobro vežejo na površine, vključno s površinami iz nerjavečega jekla.
Osnovni postopki za preprečevanje prenosa iCJD s kirurškimi instrumenti so sterilizacija ali uporaba smernic prionske dekontaminacije, ki predpisujejo avtoklaviranje pri visokih temperaturah, višjih od 121 ° C do 132 °C, ter uporabo natrijevega hidroksida. Ti postopki običajno trajajo 1 uro in niso primerni za vso kirurško opremo (npr. endoskopi). Izogibanje bolnišničnim okužbam z učinkovitim odstranjevanjem biofilmov z medicinskih pripomočkov, še posebej iz občutljivih naprav, kot so fleksibilni endoskopi, ki jih ni mogoče obdelati s pomočjo kemikalij ali visokih temperatur, je še en velik izziv v zdravstvu.
Obstaja nekaj alkalnih in encimskih detergentov za zmanjšanje prionske infektivnosti. Čeprav so redki, imajo dokazani prenosi CJD, tako imenovane iatrogene CJD (iCJD), preko medicinske opreme lahko daljnosežne posledice. Zaradi dokazov o več deset tisoč kužnih prenašalcev samo v Združenem kraljestvu, se povečuje zaskrbljenost glede morebitnega prenosa okužbe. Dolga inkubacijska doba CJD in značilno diagnostiko CJD iz možganskega tkiva, so vzroki, ki lahko privedejo do nenadzorovanega prenosa CJD preko onesnaženih kirurških instrumentov.
Leta 2011 smo patentirali postopek za encimsko razgradnjo proteinskih agregatov s pernizinom, kot so infektivnih prioni (PrPSc) različnih izvorov (miš, govedo, srna, človek), kot tudi z Alzheimerjevo boleznijo povezanih agregatov. Vendar pa je zelo nizek izplen, manj kot 0,5 mg na 1 L kulture, oviral industrijsko aplikacijo. Naš preboj v ekspresijskem sistemu E. coli je bil dosežen s kodonsko optimizacijo gena za pernizin. Več kot 20-kratno povečanje proizvodnje je odprlo nove priložnosti za industrijsko uporabo, vendar pa potreba po aktivaciji rekombinantnega pernizina in intracelularno izločanje proteina predstavlja nove ovire za industrijsko uporabo. Predlagana rešitev je uporaba relativno novega ekspresijskega sistema Streptomyces sp. in uvajanje krajše različice pernizin gena, sestavljenega brez proregije.
Cilj projekta je razviti novo učinkovito formulacijo za čiščenje/dezinfekcijo prionskih kontaminacij, ki bo temeljila na rekombinantnem pernizinu v sodelovanju z Borer Chemie AG, kot enim od vodilnih dobavitelj izdelkov za čiščenje in dezinfekcije s pomočjo vodnih raztopin.
Pomen za razvoj znanosti
Izvirni znanstveni prispevek: Predviden raziskovalni pristop v okviru tega projekta je noviteta, s katero se bo bistveno razširilo naše razumevanje mehanizmov delovanja, fizikalno-kemijskih in bioloških lastnosti arhejskega proteina pernizin, katerega bomo producirali v streptomicetah. To bo omogočilo razvoj nove formulacije za razkuževanje in dezinfekcijo prionskih infektivnih delcev v laboratorijih in za kirurške instrumente (Poklar N. Vilfan T. 2012). Projekt je zasnovan na aplikaciji, ki bazira na znanstvenih dosežkih. Dobljeni znanstveni rezultati bodo objavljeni v strokovnih revijah. Izvirni znanstveno-aplikativni dosežek bo in-vitro preizkus novih formulacij pernizina pri podjetju Borer Chemie AG. Razvoj novih formulacij in proizvodov v podjetju bodo izboljšali njihov nabor produktov. Rezultati projekta bistvenega pomena za proizvode z visoko dodano vrednostjo.
Glavni znanstveni prispevki:
(i) Razumevanje mehanizma razgradnje PrPSc in drugih TSE s pomočjo termostabilne proteaze pernizin
(ii) Uporaba Streptomyces sp. kot heterolognega ekspresijskega sistema za arhejske proteine
(iii) Razumevanje mehanizma/povezave med toplotno stabilnostjo in encimsko aktivnostjo proteinov iz hipertermofilnih arhejah
(iv) Določitev 3D strukture rekombinantne termostabilne serinske proteaze (pernizina) nam bo omogočila nadaljnjo optimizacijo encimske aktivnosti.
(v) Razvoj različnih formulacij na osnovi encimov za dekontaminacijo PrPSc ali drugih proteinskih agregatov
Pomen za razvoj Slovenije
V predlaganem projektu želimo uporabiti pernizin, ki je sposoben razgraditi infektivne prione in tako izkazuje potencialno uporabo v industriske namene. Rekombinantno obliko proteina bomo pripravili s pomočjo Streptomyces sp. Rekombinantno proteinazo bomo uporabili v novo razvitih formulacijah. Ugodni rezultati testiranja formulacij, bodo skupaj z razvojem in komercializacijo, imeli hiter in ugoden ekonomski učinek na sodelujoče partnerje. Nova razvita encimska formulacija se bo lahko uporabljala za čiščenje infektivnih PrPSc v bolnišnicah in zdravstvenih centrih in na ta način se bodo preprečevale usodne posledice zaradi okužb s TSE. Naša dva podeljena patenta (evropski patent: Compositions and Methods for Degradation of Protein Deposites and Prions; in slovenski patent: Overproducing recombinant pernisine in heterologous expression systems) bosta tako imela ugodne finančne učinke. Razvoj tehnologije, ki bazira na uporabi Streptomyces sp. kot ekspresijskega sistema bomo poskušali nadgraditi v nov patent. Uspešno sodelovanje med partnerji lahko privede do ustanovitve novega podjetja, ki bi se ukvarjalo s pripravo industrijsko pomembnih proteinov in/ali za produkcijo pernizina. Naši preliminarni rezultati obetajo uspešno izvedbo projekta in tudi objavo članka v reviji z visokim faktorjem vpliva. V raziskovalno delo na projektu bomo vključili tudi magisterske študente in doktorske študente biotehnologije. Sodelovanje med partnerji na projektu bo vključevalo tudi prenos znanja med akademsko sfero in industrijo. Uspešno sodelovanje na tem projektu lahko privede do nadaljnjih sodelovanj med partnerji na novih aplikativnih projektih z uporabo novih zanimivih protein iz A. pernix.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
