Projekti / Programi
Ohranitev ultra strukture evkariontskih in prokariontskih celic ter virusov z uporabo različnih kemičnih in zamrzovalnih metod za transmisijsko elektronsko mikroskopijo
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
| B235 |
Biomedicinske vede |
Protozoologija |
mikroskopija, kemična fiksaci elektronska ja, fiksacija z zamrzovanjem, dehidracija, substitucija, zamrzovanje pod visokim pritiskom, virusi, bakterije, evkariontske celic
Raziskovalci (5)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
03174 |
dr. Borut Drinovec |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
1999 - 2001 |
158 |
| 2. |
10514 |
Vesna Golob |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
1999 - 2001 |
4 |
| 3. |
12555 |
dr. Jošt Kuret |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
1999 - 2001 |
27 |
| 4. |
03172 |
dr. Jožefa Marin |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
2000 - 2001 |
237 |
| 5. |
08755 |
dr. Mateja Poljšak-Prijatelj |
Mikrobiologija in imunologija |
Vodja |
1999 - 2001 |
234 |
Organizacije (1)
Povzetek
Elektronski mikroskop zaradi svoje velike ločljivosti omogoča preučevanje majhnih objektov. Vendar moramo vzorce, ki jih želimo opazovati v mikroskopu predhodno ustrezno obdelati. Pri tem želimo vzorce čim manj poškodovati oz. spremeniti. Danes imamo na voljo dve skupini postopkov - kemične in fizikalne. Kemični postopki so v uporabi praktično od začetka elektronske mikroskopije, razširjeni po vsem svetu in izdelani ter prilagojeni različnim biološkim vzorcem. K fizikalnim postopkom prištevamo predvsem zamrzovalne metode, medtem, ko drugi postopki (npr. uporaba mikrovalov) ostajajo v zelo omejeni uporabi. Celice, tako evkariontske kot prokariontske, imajo visoko stopnjo strukturne organizacije, ki je posledica funkcij, ki jih opravljajo. Struktura in funkcija celičnih organelov sta soodvisni. Z uporabo različnih metod v EM stremimo k temu, da bi celico ohranili čim bliže stanju in vivo, vendar s procesi priprave celic za opazovanje organizacijo celice poškodujemo in s tem tudi spremenimo. Spremembam se ne moremo izogniti, zato bomo v praksi analizirali elektronsko mikroskopsko sliko različnih celic (evkariontskih iz različnih živalskih tkiv, celičnih kultur: HeLa, CV1; rastlinskih tkiv; prokariontskih celic: borelij; z virusi inficiranih celičnih kultur). Za stabilizacijo celic bomo uporabili različne metode fiksacije, tako standardne kemične kot fizikalne metode, ki se šele uveljavljajo v svetu in jih v Sloveniji prvi preizkušamo na različnih modelih. Pri preučevanju ultrastrukture je pomembna tudi ločljivost, ki jo v EM izboljšamo s kontrastiranjem t.j. z vnašanjem soli težkih kovin na celične strukture. Analiza vzorca pri opazovanju v EM nam da končno oceno kvalitete uporabljenih postopkov. Pri tem kot najpomembnejše dejavnike ocenjujemo obliko in velikost celic, razporeditev in število opazovanih organelov ter drugih sestavnih elementov celic oz. tkiv. Način fiksacije, ki jo uporabimo pred opazovanjem celic ali tkiva v elektronskem mikroskopu mora biti tak, da vsaka molekula, idealno vsak ion ostane na svojem mestu. Kvaliteta fiksacije kot prvega koraka na poti k opazovanju vzorca v EM je namreč zelo pomembna. Z ustrezno fiksacijo ohranimo v vzorcu kar največ informacij, z neprimerno pa vzorec lahko uničimo še pred nadaljevanjem. Zelo pomemben je tudi čas od odvzema vzorca do stika s fiksativom, ki mora biti čim krajši.
Stopnji fiksacije sledita stopnji dehidracije in vklapljanja v smole, ki imata lahko velik vpliv na kemično sestavo celic oz. tkiva. Nezaželjeni pojavi, ki spremljajo kemično fiksacijo in nanjo vezane nadaljnje postopke so izguba epitopov npr. z ekstrakcijo molekul in struktur; sprememba v obliki in prostornini celic, prerazporeditev organelov, ki vpliva na kvantitativna preučevanja; sterična sprememba epitopov, ki jo povzroči reakcija s fiksativi; opazna kemična sprememba epitopov z neposredno reakcijo s fiksativi, predvsem denaturacija proteinov. S fizikalnimi metodami fiksacije se vsem neželjenim spremembam izognemo. Fizikalne metode so danes v glavnem zamrzovalne metode, s katerimi vzorec stabiliziramo zelo hitro (v tisočinki sekunde), brez kakršnihkoli kemičnih reakcij. Tak vzorec je ob primernem postopku odtajevanja sposoben preživetja, medtem, ko celico s kemičnimi postopki fiksacije ubijemo. Glavni problem in slaba stran zamrzovanja je nastanek kristalov, ki pa jih v elektronskem mikroskopu zlahka prepoznamo. Metoda postopnega zniževanja temperature (PLT - Progressive Lowering of Temperature) je vmesna stopnja med kemičnimi in pravimi zamrzovalnimi postopki. Je metoda pri kateri vzorec še vedno fiksiramo s kemičnimi sredstvi, med postopkom dehidracije pa temperaturo postopno znižujemo. S to metodo naj bi predvsem odpravili neželjene spremembe, ki spremljajo dehidracijo na sobni temperaturi in tako izboljšali ohranjenost ultrastrukture ter antigenosti vzorca.
Pri citokemičnih in imunocitokemičnih metodah, kjer v vzorcu iščemo prisotnost in razporeditev antigenov, moramo zagotoviti čim manjšo...
