Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARRS

Mehanizem delovanja in sodelovanja treh ključnih listerijskih virulentnih faktorjev

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
1.05.00  Naravoslovje  Biokemija in molekularna biologija   

Koda Veda Področje
P340  Naravoslovno-matematične vede  Lipidi, steroidi, membrane 

Koda Veda Področje
1.06  Naravoslovne vede  Biologija 
Ključne besede
virulencni dejavniki, proteini, lipidne membrane, tridimenzionalna zgradba, mehanizem delovanja
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (16)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacij
1.  37453  dr. Saša Aden  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2020 - 2021  37 
2.  24290  dr. Matej Butala  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2018 - 2021  224 
3.  32099  dr. Maja Grundner  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2018 - 2021  26 
4.  53283  Maja Hostnik  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2021  11 
5.  38255  dr. Andreja Kežar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2020 - 2021  31 
6.  35382  dr. Matic Kisovec  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2018 - 2021  67 
7.  53439  dr. Magdalena Kulma  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2021  29 
8.  36425  dr. Tea Lenarčič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2018 - 2019  43 
9.  33923  dr. Polona Mrak  Naravoslovje  Raziskovalec  2018 - 2021  92 
10.  35371  dr. Maruša Novak  Biotehnologija  Raziskovalec  2018  34 
11.  50709  Nejc Petrišič  Biokemija in molekularna biologija  Mladi raziskovalec  2018 - 2021  11 
12.  12048  dr. Marjetka Podobnik  Biokemija in molekularna biologija  Vodja projekta  2018 - 2021  288 
13.  15328  dr. Kristina Sepčić  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2018 - 2021  696 
14.  38479  dr. Aleksandra Šakanović  Nevrobiologija  Raziskovalec  2019 - 2021  24 
15.  38473  Tomaž Švigelj    Tehnični sodelavec  2018 - 2021  11 
16.  16381  dr. Nada Žnidaršič  Biologija  Raziskovalec  2018 - 2021  228 
Organizacije (2)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacij
1.  0104  Kemijski inštitut  Ljubljana  5051592000  20.387 
2.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  64.118 
Povzetek
Listeria monocytogenes je fakultativno intracelularna bakterija, in je glavni vzrok resne bolezni, ki se prenaša s hrano, in prizadene predvsem posameznike z oslabljenim imunskim sistemom. Čeprav ljudje redko obolijo, pa je smrtnost visoka, in sicer 20-30%. Zelo pomembnen podatek je, da je listerioza veliko bolj pogosta pri domačih živalih (sesalci in perjad), še posebej pa pri prežvekovalcih. Listeriozo lahko pri ljudeh in živalih sicer zdravimo tudi z antibiotiki, v primeru zgodnje diagozne, vendar je lahko kljub temu precej usodna, predvsem za živali. Virulenco L. monocytogenes omogoča zelo kompleksen in koordiniran intracelularni življenjski cikel, ki je sestavljen iz več korakov: adhezija na gostiteljevo celico, invazija, znotrajcelično pomnoževanje in gibanje ter razsejanje med celicami. Celovitost vsakega koraka je odvisna od orkestrirane aktivnosti specializiranih bakterijskih faktorjev, ki jih zelo natančno kontrolirajo specifični regulatorji. Ko se bakterija po internalizaciji znajde v tarčni celici v fagosomski vakuoli, uporabi listeriolozin O (LLO) in dve fosfolipazi, Pi-PLC in PC-PLC, za razparanje vakuole, pobeg iz nje ter rasejanje med celicami, kar ključni koraki v patogenezi L. monocytogenes. Razpad vakuolne membrane povzroči LLO s svojo porotvorno aktivnostjo, to pa je dejansko ključni dogodek med bakterijsko infekcijo, medtem pa ko fosfolipazi delujeta kot podpora LLO za uspešno virulenco. LLO se izloča kot topen monomeren protein, ki se veže na membrane z visoko koncentracijo holesterola. Po vezavi na membrano se začne sestavljati v oligomerne strukture, ki se nato vgreznejo v lipidni dvosloj membran, pri em nastanejo funkcionalne transmembranske pore. V nasprotju s homolognimi toksini iz drugih patogenih bakterij, pa LLO ne tvori tipičnih obročastih por z notranjim premerom okili 40 nm, ampak namesto tega naredi transmembranske razpoke neregularnih oblik in velikosti, ki na koncu dosežejo dimenzije, ki bi lahko služile za pobeg bakterij iz vakuol. Do sedanje raziskave naše skupine in drugih so pokazale, da je mehanizem nastanka por odvisen od vplivov okolja, kot je temperatura, pH in lipidna sestava membrane. Medtem ko so te raziskave pomembno prispevale k razumevanju mehanizma delovanja LLO, pa še vedno nimamo podatkov, ki bi nam prikazovali to edinstevno plastičnost LLO por in odvisnost le te od zunanjih dejavnikov, pri visoki ločljivosti. Ravno tako še niso znane podrobnosti vpliva bakterijskih fosfolipaz na membrane, ravno tako ne tudi strukture in mehanizem delovanja na molekularnem nivoju, pa tudi sodelovanje z LLO. Zato želimo s to predlagano raziskavo odgovoriti na ta nerešena vprašanja z uporabo širokega spektra modernih metodoloških pristopov, od molekularne biologije, proteinske in lipidne biokemije in biofizike, do strukturne biologije, vključno z x-žarkovno kristalografijo in krio-elektronsko mikroskopijo. Verjamemo, da bo predlagana raziskava jasno pokazala pomembne lastnosti LLO por, kot je plastičnost, ki je pomemna za natačen potek dogodkov med infekcijo z L. monocytogenes. Poudariti moramo, da želimo doseči podatke blizu atomske ločljivosti, kar bo doprineslo ključen in podroben vpogled v tvorbo pore z LLO, kot sam ali pa skupaj z obema fosfolipazama, kar je nujno za razumevanje dogodkov in vivo med infekcijo. To bo ključno prispevalo k razumevanju listerijske patogeneze in s tem razvoju terapetvskih strategij za preprečevanje širjenja L. monocytogenes ter  s tem sistemske infekcije ljudi in živine.
Pomen za razvoj znanosti
Medtem ko so pore homologov LLO že opazovali s krio-EM, sicer pri relativno nizkih ločljivostih (Gilbert s sod., 2014; van Pee s sod., 2017), pa so pore LLO doslej opazovali le z AFM in TEM (Podobnik s sod., 2015; Mulvihill s sod., 2015; Ruan s sod., 2016). Eden izmed glavnih razlogov je verjetno visoka plastičnost LLO por in posledično velika heterogenost por LLO v primerjavi z drugimi proteini CDC. Predpostavljamo, da pregledovanje različnih lipidnih kombinacij v določenih časovnih točkah lahko vodi do uspešne priprave in ločitve stabilnih LLO oligomernih oblik. Z razvojem novih metodoloških pristopov in protokolov, bomo omogočili vpogled visoke ločljivostji (blizu atomski) v take komplekse in interakcije med posameznimi elementi. To bo predstavljalo ogromen uspeh in originalen prispevek na področju tako pomembnega virulentnega faktorja, kot je LLO. Pokazano je namreč bilo, da ne samo obročaste pore, ampak tudi loki igrajo pomembno vlogo v delovanju porotvornih proteinov, še posebej pa v primeru LLO (Gilbert s sod., 2014; Rojko in Anderluh, 2015; Podobnik s sod., 2015, Mulvihill s sod., 2015; Ruan s sod., 2016). Ta prvi del bo pomembna podlaga za mehanistične raziskave sodelovanja LLO z dvema listerijskima fosfolipazama ter interakcij med omenjenimi proteini in lipidnimi membranami, kar doslej še ni bilo narejeno. Uporabili bomo različne tehnike za vizualizacijo, biofizikalne pristope ter metode strukturne biologije. Naredili bomo torej podroben pregled intermolekularnih interakcij (direktne ali indirektne; protein-protein & protein-lipidi) na molekularnem nivoju. S čim večjo ločljivostjo bomo poskusili določiti vpliv fosfolipaz na zgradbo oligomerov LLO, kar bo predstavljalo velik in originalen prispevek na tem raziskovalnem področju. Zaradi hude patogeneze je primerno raziskovati mehanizem delovanja posameznih virulencˇnih faktorjev, kot so LLO in fosfolipaze, da bi lahko temeljito razumeli molekularno ozadje patogeneze listerij, in s tem prispevali k napredku preventivnih ukrepov in intervencij, ki bi vodile v manjšo stopnjo obolevanja in boljših rezultatov terapije pri ljudeh in živalih. Pri tem projektu bodo vključeni tudi doktorski, magistrski in do­diplomski študentje, tako da bodo same ideje, izkušnje in znanje o listerijah ter raziskovalnih metodah prenešene tudi na mlade generacije raziskovalcev in raziskovalk. Rezultate bomo objavili v mednarodnih znanstvenih revijah z visokim faktorjem vpliva in jih aktivno predstavljali na znanstvenih konferencah v obliki znanstvenih predavanj in postrov. Načrtujemo tudi predstavitev za splošno javnost preko socialnih omrežij, časnikov in drugih medijev (predavanja za splošno javnost, radijske oddaje itd.)
Pomen za razvoj Slovenije
While pores of LLO homologes have been observed before by cryo-EM, at relatively low to medium resolution (Gilbert et al., 2014; van Pee et al., 2017), LLO pores have been imaged so far only by negative stain TEM and AFM (Podobnik et al., 2015, Mulvihill et al., 2015; Ruan et al., 2016). One of the main reasons is probably the high plasticity and thus heterogeneity of LLO oligomeric formations in comparison to other CDCs. We expect that screening of various lipid and detergent combinations at particular time points could lead to successful capture and separation of various stable and structured aggregates of LLO. We plan to develop novel methodological approaches and protocols to obtain (near) atomic resolution insights into these structures and thus interactions, which will represent an immense success and thus a huge and original contribution to studies involving the key virulence factor LLO. Namely, not only ring shaped pores, but also arcs have been shown to play important roles in functioning of pore forming proteins, and especially in the case of LLO (Gilbert et al., 2014; Rojko and Anderluh, 2015; Podobnik et al., 2015, Mulvihill et al., 2015; Ruan et al., 2016). This initial step will be an important basis to study the interplay or synergy of LLO and the two listerial phospholipases, as well as their interactions with lipid membranes at the mechanistic level, using various imaging biophysical and structural biology methods, which has not been done to date. We aim to perform a detailed screening of these intermolecular interactions (direct or indirect, protein-protein & protein-lipid) at a molecular level as well as study potential effects of phospholipases on structures of LLO oligomers, again aiming at highest possible resolutions, which will represent a major and by all means original contribution to this research field. It is thus important to study the mechanism of action of individual virulent factors like LLO and phospholipases, to thoroughly understand the background of Listeria pathogenesis and thus learn about potential ways to prevent it. This research will in long term contribute to the improvement of preventive measures and interventions, leading to lower incidence of listeriosis and better therapy outcomes in humans and animal stock. This project will include also PhD, MSc and BSc students, thus applying the ideas, experiences and knowledge on Listeria and various research methods to young generations of scientists. We aim to publish the outcomes of our research in scientific journals of high impact and will also present them at scientific conferences, in forms of lectures and posters. We will also attempt to present our data to general public via publishing in social media, newspapers and other media (lectures for general public, radio, etc).
Zgodovina ogledov
Priljubljeno