Projekti / Programi
Molekularno slikanje v celici
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.02.00 |
Naravoslovje |
Fizika |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B191 |
Biomedicinske vede |
Rastlinska biokemija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.03 |
Naravoslovne vede |
Fizika |
slikovna masna spektroskopija, sekundarni molekularni ion, TOF, molekularno slikanje, MeV-SIMS, težki visokoenergijski ioni, elektronska desorpcija
Raziskovalci (11)
Organizacije (2)
Povzetek
Slikovna masna spektrometrija (angl. Imaging Mass Spectrometry , IMS) omogoča vpogled v biokemijske procese s slikanjem molekularnih porazdelitev v bioloških tkivih, s čimer nudi vpogled v kompleksnost fizioloških procesov. Razpoložljive tehnologije IMS imajo pomembne omejitve za slikanje molekularnih porazdelitev na subcelularni ravni, saj fizikalni procesi za ekstrahiranje biomolekul iz vzorca bodisi uničijo šibke vezi biomolekul ali niso sposobne ekstrahirati biomolekul z dovolj majhnega območja na vzorcu. Predlagani projekt »Molekularno slikanje znotraj celice« (angl. Molecular Imaging Inside The Cell, MICE) bo razvil novo in neprekosljivo tehnologijo IMS, ki bo združevala vrhunsko znanje fizike, biomedicine in inženirstva pri tkivnem krioprocesiranju, formiranju ionskih žarkov z visoko energijsko energijo in masne spektrometrije za zajem slik molekularnih porazdelitev znotraj celic bioloških tkiv. Slike porazdelitev nefragmentiranih molekul, težjih od 2 kDa, bodo zabeležene z lateralno ločljivostjo, boljšo od 500 nm, in s tem močno presegale zmogljivost današnjih tehnologij IMS. Za mehanizem molekularnega slikanja bomo uporabili proces sekundarne ionske emisije, ki jih desorbirajo težki ioni energij MeV s površine izolacijskih materialov. Proces uporabljajo v nastajajoči tehnologiji IMS, znani pod akronimom MeV-SIMS (Sekundarna ionska masna spektrometrija z ioni energije MeV ). Z obstoječim sistemom ionske optike na tandemskem pospeševalniku v Ljubljani bomo v tako imenovanem nizkem tokovnem načinu oblikovali visokoenergetske fokusirane ionske žarke z energijo v območju med 4 in 10 MeV, kjer ionski žarek z intenziteto 5000 ionov na sekundo in premerom 500 nanometrov zadene rezino biološkega tkiva, jo preleti in zadene enokanalni ionski pomnoževalec, ki sproži merjenje časa preleta. Močan prenos energije iz hitrih ionov v elektrone tarčne snovi povzroči lokalno visoko povišanje temperature elektronov vzdolž trajektorije in ustvari fononski val, ki mehko desorbira nefragmentirane sekundarne molekularne ione iz vzorca. V tkivu, ki ga vzdržujemo v zamrznjenem hidriranem stanju v visokem vakuumu, nastanejo sekundarni molekularni ioni, ki jih pomerimo v masnem spektrometru na osnovi časa preleta. Nastala tehnologija IMS bo vizualizirala intracelularno kemijo z lateralno ločljivostjo, primerno za študij biomolekularnih procesov na nivoju subcelularnih struktur. S tem bo tehnologija omogočala nov vpogled in odprla nova obzorja v razumevanju celice kot osnovnega gradbenega elementa življenja.
Pomen za razvoj znanosti
Da bi presegli obstoječe omejitve sodobnih tehnik slikovne masne spektroskopije, bomo razvili novo tehnologijo, ki bo nudila možnosti meritev molekularnih porazdelitev do resolucije 500 nm, in jo uporabili za slikanje izbranih fizioloških procesov v notranjosti celice, vključno z nekaterimi najbolj znanstveno zanimivimi biokemičnimi procesi in vivo. Vključitev merilnega sistema na podlagi elektronske desorpcije s hitrimi težkimi ioni, ki ima kombinacijo lateralne ločljivosti pod 500 nm in sposobnost učinkovite nefragmentirane desorpcije velikih biomolekularnih ionov, bo tehnologija, razvita znotraj projekta, omogočila molekularno slikanje z visoko lateralno ločljivostjo in kemijsko občutljivostjo znotraj celice, pa tudi sposobnost merjenja analitičnih masnih spektrov iz nevidnih majhnih količin vzorcev velikostnega reda 10-10 mikrolitrov. MICE bo ustvaril neprekosljivo tehnologijo za vizualizacijo, ki bo razkrila biokemijo celic in bo dopolnjevala nove tehnike intracelularnih mikroskopov z ločljivostjo 500 nanometrov, ki bo prva s pomočjo IMS zaznala intracelularno biokemijo. Člani projektne skupine se bodo ukvarjali z zahtevnim izzivom, da bi razvili vrhunsko tehnologijo, ki bo omogočila dosedaj neizvedljivo vizualizacijo molekularnih procesov znotraj celic, vključno s prenosom signala vzdolž sinapse, odzivom celic na sintetične kemikalije in zdravila ter mehanizme ekspresije genov.
Projekt je sestavljen iz več težkih in kritičnih nalog, kjer je treba uvesti nove rešitve in zamisli za premagovanje ozkih grl v razpoložljivi raziskovalni metodologiji in tehnologiji v masni spektrometriji.
Med najbolj kritičnimi so: A) tvorba visokoenergijskega ionskega nanožarka z energijo MeV in premerom 500 nanometrov s kvadrupolno optiko, B) tehnologijo pritrditve zamrznjenega hidratiranega tkiva nad brezvodnim prevodnim substratom in njegovega ravnanja / prenosa iz pripravljalna orodja v analitsko okolje.
Te naloge bo obravnavala delovna skupina članov z interdisciplinarnim strokovnim znanjem, z izmenjavo in uresničevanjem njihovih idej ter z intenzivno komunikacijo z raziskovalno skupnostjo, ki se ukvarja s temi problemi, tudi v okviru preteklih in prihodnjih mednarodnih projektov.
Predvideno je zelo vznemirljivo povračilo: doslej neizvedljiva vizualizacija molekularnih porazdelitev znotraj celic, potrjevanje ali zavračanje obstoječih modelov znotrajceličnega metabolizma in odpiranje novega raziskovalnega podpolja subcelularne molekularne mikroskopije.
Pomen za razvoj Slovenije
To overcome the existing limitations in the state of the art IMS to resolve molecular processes at subcellular scale, the project will develop new technology able to probe the molecular distribution down to 500 nm resolution, and deploy it for the imaging of selected physiological processes inside the cell, including some most scientifically interesting biochemical processes in vivo. Incorporating the probing mechanism based on electron desorption by swift ion impact featuring the combination of sub-500 nm lateral resolution and the ability of efficient non-fragmented desorption of large biomolecular ions, the technology developed within the project will enable molecular imaging with unprecedented lateral resolution and chemical sensitivity inside the cell, as well as the ability to measure analytical grade high-resolution mass spectra from so far unseen small volumes of samples on the order of 10-10 microliters. MICE will create unsurpassed visualisation technology revealing the biochemistry of cells and will complement new techniques of intracellular microscopies with nanometre resolution, being the first to image intracellular biochemistry through IMS. Incorporating high-resolution mass spectrometry, it will support the identification of the observed biomolecules, and enable discoveries of new biomolecules engaged in physiological processes. The members of the project team will be engaged in a demanding challenge to develop world leading technology, allowing as yet unseen visualisations of molecular processes inside cells, including signal transmission along synapses, responses of cells to synthetic chemicals and drugs, and the mechanisms of gene expression.
Project consists of several difficult and critical tasks, where new solutions and ideas need to be implemented to overcome bottlenecks in the available research methodology and technology in Imaging Mass Spectrometry, reaching the sub-100 nanometer resolution.
Among the most critical are: A) the formation of swift ion nanobeam with MeV energy and sub-500 nanometre diameter with quadrupole optics, B) technology of suspension of the frozen hydrated tissue over the background-free conductive substrate and its handling/transfer from the preparatory tools into the analytical environment.
These tasks will be addressed with a working team of members with interdisciplinary expertise, by exchanging and implementing their ideas, as well as in the intense communication with the research community working on these problems, also within undergoing and future international projects.
A very exciting pay-back is foreseen: the so-far unseen visualization of molecular distributions inside the cells, confirming or rejecting the existing models of intra-cellular metabolism, and opening new research subfield of subcellular molecular microscopy.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
