Projekti / Programi
Uravnavanje fuzijske pore in motnje skladiščenja v lizosomih
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.03.00 |
Medicina |
Nevrobiologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B470 |
Biomedicinske vede |
Fiziologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
eksocitoza, fuzijska pora, holesterol, lizosom, bolezni motenj skladiščenja v lizosomih
Raziskovalci (7)
Organizacije (2)
Povzetek
Predlagani projekt je usmerjen v razumevanje enega najpomembnejših mehanizmov s katerim celice med seboj komunicirajo, t.j. v uravnavano eksocitozo. Tu citoplazemski, z membrano obdani mešički, ki v svojem lumnu ali pa v membrani mešička, transportirajo signalne molekule do plazmaleme. Osredotočili se bomo na lizosome, strukture, ki so nekoliko večje od sekretornih mešičkov, ki so v sinapsah ali tistih, ki imajo elektronsko gosto notranjost.
Odkritje lizosoma, enega od prvih celičnih organelov, v letu 1955, je odprlo raziskave znotrajceličnega transporta v celicah evkariontov. Zasidrano je stališče, da imajo lizosomi pomebno vlogo v fiziologiji celice, a ne zgolj pri razgradnji, avtofagiji, skladiščenju in recikliranju snovi, pač pa tudi v signaliziranju. Delovanje lizosomov poteka prek encimov, ki jih vsebujejo v lumnu in tudi prek struktur v membrani, ki omogočajo učinkovito fuzijo teh organelov z drugimi, vključno s plazmalemo.
Motnje v skladiščenju lizosomov se zrcalijo v več kot 50 tipih bolezni (an. Lysosomal storage diseases, LSDs). To je večinoma posledic mutacij encimov, ki so aktivni v lumnu lizosoma, v redkejših primerih pa tudi zaradi motenj v vezikularnem transportu lizosomov. Pri bolnikih so znaki zelo različni, od asimptomatičnih stanj, do kroničnih in tudi do akutnih letalnih nevropatičnih izidov, z zgodnjimi in poznimi zapleti. Približno dve tretjini bolezni LSD je nevropatičnih.
Čeprav so posamezne oblike bolezni LSD dokaj redke, pa je, če vzamemo vse oblike bolezni LSD skupaj, zanje značilna prizadetost več organov. Za te oblike resnično nimamo učinkovitih terapij, in sicer kljub temu, da je zanje značilna visoka stopnja obolevnosti in umrljivosti. Trenutne oblike zdravljenja teh bolezni so drage in potekajo celotno življenje, kar predstavlja veliko breme za posameznike in njihove družine, kakor tudi za zdravstvene sisteme. Zanimanje za bolezni LSD pa je v zadnjem času poraslo, ker se kaže, da so defekti v delovanju lizosomov povezani tudi z nevrodegeneracijo. Razumevanje skupnega imenovalca bolezni LSD in nevrodegeneracije, na ravni celičnih mehanizmov, predstavlja zelo pomemben izziv, ki ga je potrebno nasloviti.
Ker se pri boleznih LSD v lizosomih kopičijo lipidi in holesterol, bomo študirali, kako to vpliva na uravnavanje fuzijske pore (in posledično zlivanja mešičkov s plazmalemo), ki je verjetno moteno zaradi spremenjene vsebnosti holesterola. Takoj po fuziji mešičkov s plazmalemo se prek fuzijske pore izloča vsebnost mešičkov, zato je ta struktura pomembna za transport molekul med celično notranjostjo in zunanjostjo. Naša hipoteza predvideva, da holesterol vpliva neposredno na samo fuzijsko poro in posledično moti omenjeni transport molekul v primeru, ko je vsebnost holesterola povečana, kakor je to pogosto prisotno pri različnih boleznih LSD. Zato bomo raziskali naravo fuzije mešička s plazmalemo, na ravni posameznega mešička z najbolj občutljivo elektrofiziološko metodo, s katero lahko merimo spremembe kapacitivnosti membrane. Ta je linarno sorazmerna površini, zaradi česar lahko neposredno spremljamo fuzijo membrane mešička s plazmalemo. Poskuse bomo izvedli tako, da bomo umetno spreminjali količino holesterola v živih celicah. Poleg tega bomo uporabili nove fluorescenčne markerje za označevanje membranskih domen, ki so obogatene s holesterolom. Meritve bomo izvedli z visoko-ločljivostno fluorescenčno mirkoskopijo, da bi ugotovili morebitno povezanost med strukturami membrane, ki so obogatena s holesterolom in mešički. Študirali bomo tudi celice iz modelov živali za LSD.
Predlog raziskave je po naravi izrazito multidisciplinaren. Razkril bo enega od nerešenih problemov v celični biologiji, uravnavanje fuzijske pore s holesterolom. Rezultati te raziskave bodo prispevali k določitvi strategije za razvoj novih zdravljenj LSD, za katere pa je mehanizem celične okvare še nepoznan. Tako rezultati te študije nosijo velik translacijski potencial za klinične aplikacije.
Pomen za razvoj znanosti
Predmet raziskav v predlaganem projektu je uravnavana eksocitoza, ki je eden od najbolj pomembnih načinov komunikacije med celicami. Pomembnost raziskav uravnavane eksocitoze v zadnjih petih desetletjih se med drugim odraža v Nobelovih nagradah za fiziologijo in medicino podeljenih leta 1970 (B. Katz, U. Euler in J. Axelrod) in leta 2013 (J.E. Rothman, R.W. Schekman, T. Sudhof) in v številnih boleznih povezanih z motnjami v procesu uravnavane eksocitoze, vključno z boleznimi, ki se izražajo z motnjami skladiščenja v lizosomih. Kljub intenzivnim raziskavam so številna vprašanja povezana z mehanizmi uravnavane eksocitoze še neodgovorjena. Eno takih vprašanj predstavlja vloga različnih lipidov pri fuziji membran, ki je ena od zadnjih stopenj uravnavane eksocitoze. V predlaganem projektu bomo raziskali vlogo holesterola pri fuziji mešičkov s plazemsko membrano, kar je relevantno za razumevanje okvare pri boleznih z motenim skladiščenjem v lizosomih. Razumevanje teh procesov je fragmentarno tudi zaradi eksperimentalne nedostopnosti. Zato bomo uporabili metode, ki smo jih postavili in jih dodatno razvijamo v našem laboratoriju in omogočajo spremljanje fizioloških parametrov na ravni posamezne celice, celičnih organelov in posameznih molekul. Med omenjenimi metodami izstopata mikroskopija STED (razvita v sodelovanju s prof. dr. Stefan W. Hellom, prejemnikom Nobelove nagrade za kemijo 2014) in elektrofiziološke meritve membranske kapacitivnosti, za katero smo razvili ključne dele opreme (ojačevalnik, filter in programska oprema za zajemanje in analizo signalov) v našem laboratoriju.
Predlagani projekt bo:
a) poglobil razumevanje temeljnih celičnih procesov,
b) pomemben za prepoznavo novih tarč za razvoj novih terapevtikov,
c) pripomogel k razumevanju okvare pri boleznih z motnjo skladiščenja v lizosomih in pripomogel k nadaljnjemu razvoju naprednih eksperimentalnih metod.
Pomen za razvoj Slovenije
The proposed project aims to understand one of the most important mechanisms by which cells communicate with each other; regulated exocytosis. The relevance of this field of neurobiology is, among others, empahsized by two Nobel prizes that have been awarded in the last five decades (in 1970 to B. Katz, U. Euler, J. Axelrod, and in 2013 to J.E. Rothman, R.W. Schekman, T. Sudhof). Moreover, the impairment of exocytosis can lead to the development of several pathological conditions, including to lysosomal storage diseases. However, the key impairments are still unknown. One of the unresolved questions is linked to the role of lipids, such as cholesterol, in one of the last steps of exocytosis, i.e. in the fusion of vesicles with the plasma membrane. In lysosomal storage disease, where lipids accumulate in vesicles, this likely affects the nature of vesicle fusion with the plasma membrane. In part the knowledge of fusion pore regulation is still fragmental due to experimental inaccessibility. Therefore, we will use methods, which we introduced and developed in our laboratory to monitor physiological parameters at single cell, single organelle, and at single molecule level. These methods include STED microscopy (we have developed a two color STED system in colaboration with the research group of prof. dr. Stefan W. Hell) and electrophysiological monitoring of the membrane capacitance (we have developed our own lock-in patch-clamp amplifier, low-pass filter unit and software for acquisition and analysis).
In summary, the proposed project will:
a) generate new insights into the field of neuroscience,
b) be useful for discovering new therapeutic processes and targets,
c) help to address question on mechanisms in lysosomal storage diseases and will advance some of the already cutting edge technologies.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo
