Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Stabilnost nove vrste kvadruplesov DNA (AGCGA) in njihovo prepoznavanje z nanotelesi

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
1.04.02  Naravoslovje  Kemija  Strukturna kemija 

Koda Veda Področje
P003  Naravoslovno-matematične vede  Kemija 

Koda Veda Področje
1.04  Naravoslovne vede  Kemija 
Ključne besede
kvadrupleks, nanotelo, ponovitev AGCGA, struktura, zvitje, vezanje, termodinamika
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (7)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  36924  dr. San Hadži  Kemija  Raziskovalec  2019 - 2022 
2.  54005  Mojca Hunski  Kemija  Raziskovalec  2020 - 2021 
3.  15669  dr. Jurij Lah  Kemija  Vodja  2019 - 2022 
4.  03422  dr. Brigita Lenarčič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2021  36 
5.  23575  dr. Miha Pavšič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022 
6.  15293  dr. Črtomir Podlipnik  Kemija  Raziskovalec  2019 - 2022 
7.  53449  Uroš Zavrtanik  Kemija  Mladi raziskovalec  2019 - 2022 
Organizacije (1)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0103  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo  Ljubljana  1626990  1.129 
Povzetek
Leta 1953 sta Watson in Crick predstavila strukturo dvoverižne DNA, ki je postala trdno vpeta v kulturni spomin človeštva. Vendar pa je DNA sposobna zavzeti tudi druge (nekanonične) strukture, ki se pojavljajo samo v specifičnih kontekstih. Na primer, splošno znani so tako imenovani G-kvadrupleksi (G4), ki nastanejo iz z gvanini bogatih zaporedij baz, in i-motivov, ki se oblikujejo iz komplementarne s citozini bogate verige. Čeprav so bile te strukture proučevane z različnih vidikov, je njihova vloga pri regulaciji genov in njihova povezave z boleznimi, kot so rak, Alzheimerjeva bolezen in sladkorna bolezen, še vedno predmet obsežnih raziskav. Tradicionalno so se nekanonične strukture DNA proučevale in vitro, njihov obstoj v celicah pa je bil predmet razprav. Osnovo za odgovor na to vprašanje predstavljajo študije, ki so se opirale na odkrivanje G4 in i-motivov z uporabo specifičnih protiteles, razvitih z uporabo sintetičnih knjižnic protiteles.   V zadnjem času je bilo odkrito novo zvitje DNA v nekanonično strukturo, imenovano AGCGA-kvadrupleks, ki se tvori iz baznih zaporedij s ponovitvami 5'-AGCGA-3 '. Na strukturni ravni se ti kvadrupleksi stabilizirajo z G-A in G-C baznimi pari, ki tvorijo GAGA- in GCGC-kvartete. V nasprotju z G4 te strukture niso stabilizirane s specifično vezavo kationov in so neobčutljive na njihovo naravo. Bioinformacijska študija je identificirala zaporedja s ponavljajočimi se motivi AGCGA v več kot 40 človeških genih, povezanih z regulacijo osnovnih celičnih procesov, nevroloških motenj, raka in nenormalnosti pri razvoju kosti in hrustanca, mutacije teh zaporedij pa so povezane z avtizmom.   Glavni cilj predlaganega projekta je, ugotoviti, ali se AGCGA-kvadrupleksi tvorijo in vivo. To bo zahtevalo razvoj orodij za odkrivanje, specifičnih ligandov, ki bodo prepoznali AGCGA-kvadrupleks v celičnem oz. nativnem kontekstu. Načrtujemo razvoj nanoteles (enoverižnih kamelidnih protiteles), ki prepoznajo AGCGA kvadrupleks. Interakcije z nanotelo-AGCGA-kvadrupleks bodo preučevane v kontekstu afinitete, specifičnosti, selektivnosti in strukturnih vidikov prepoznavanja, kar bo rezultiralo v vrsti dobro karakteriziranih ligandov za detekcijo AGCGA-kvadrupleksov. Na koncu bodo izbrani ligandi (nanotelesa) uporabljena za odkrivanje AGCGA-kvadrupleksov v celicah z imunofluorescenčnimi tehnikami. Hkrati predlagamo študijo stabilnosti AGCGA-kvadrupleksa in vitro z uporabo biofizikalnih tehnik za ugotavljanje, kako različni pogoji (koncentracija kationov, aktivnost vode, nagneteno okolje: »crowding«) vplivajo na njegovo stabilnost. Ta bo podprla ugotovitve študij in vivo in služila kot podpora hipoteze, da so AGCGA-kvadruplex stabilni in vivo. Ugotavljanje potencialnega obstoja nove vrste nekanonične strukture DNA strukture in vivo bo močno spodbudilo na razvoj na področju biologije nekanonične DNA, medtem ko bodo razvita specifična protitelesa proti AGCGA-kvadrupleksom predstavljala pomembno orodje za nadaljnje raziskave nekanoničnih DNA.
Pomen za razvoj znanosti
Druge študije, ki so se osredotočale na odkrivanje struktur G4 in i-motiva, so uporabljale specifična Fab protitelesa. Ta vrsta protiteles se bistveno razlikuje od nanoteles, ki do sedaj po naših podatkih niso bila uporabljena za prepoznavanje nekanoničnih struktur DNA. Pomembna prednost nanoteles je v tem, da se lahko z velikim uspehom uporabijo kot kristalizacijska pomagala (v bazi podatkov PDB je več kot dvakrat več kompleksov z nanotelesi kot s klasičnimi protitelesi Fab). V primerjavi z drugimi študijami, ki razvijajo protitelesa proti nekanoničnim strukturam DNA, bomo posvetili velik pomen karakterizaciji prepoznavanja tarč nanoteles na molekularni ravni (selektivnost, natančno določanje afinitete, navzkrižne reaktivnosti in, kar je ključno, strukturnih vidikov priznavanja kvadrupleksov) . S tega vidika želimo znanstveni skupnosti dati novo, močno uporabno in dobro karakterizirano orodje. Poleg tega komplementarna študija stabilnosti AGCGA kvadrupleksov  s pomočjo termodinamične analize (naloga 3), dala globlji vpogled v gonilne sile, ki stabilizirajo te strukture in vitro in in vivo.   Pričakovani rezultat projekta, ocena stabilnosti AGCGA-kvadrupleksa in vivo, bo pomemben in edinstven rezultat na področju biologije nekanonične DNA. Če se ugotovi prisotnost nove strukture in vivo, bo to spodbudilo nadaljnje raziskave fiziološke pomembnosti teh struktur. Poleg tega bo predlagani razvoj dobro karakteriziranih nanoteles, ki ciljajo na AGCGA-kvadruplekse, predstavljal močno uporabno orodje za znanstveno skupnost. Omeniti je treba tudi, da do zdaj ni na voljo nobenih strukturnih podatkov o vezanju protiteles in nekanoničnih DNA. Za  proteine in nekanonične DNA pa so ti izredno redki, omejeni le na modele peptidov. Možen izid tega projekta (kristalne strukture kompleksov nanotelo-kvadrupleks) bo zapolnil to vrzel in osvetlil, kako lahko proteini prepoznajo nekanonične strukture DNA.
Pomen za razvoj Slovenije
Other studies which focused on detecting G4 and i-motif structures used specific Fab antibodies. This type of antibody construct significantly differs from nanobodies which, to our knowledge, have not been used to target any non-canonical DNA structures so far. An important advantage of nanobodies is that they may be used as crystallization chaperones with high success (there are over twice as much nanobody-target complexes in PDB database compared to Fab complexes). Compared to other studies developing antibodies targeting non-canonical DNA structures we will give a strong emphasis on the characterization of nanobody-target recognition at molecular level (selectivity, precise determination of affinity, cross-reactivity and, crucially, structural aspects of quadruplex recognition). In this light, we want to deliver a novel, powerful and well-characterized tool to the scientific community. Furthermore, the complementary picture regarding AGCGA stability will be provided by thermodynamic analysis (Task 3), which will give deeper insights into the driving forces that stabilize these structures. The expected results of the project, the assessment of AGCGA-quadruplex stability in vivo, will be an important and unique result in the field of non-canonical DNA biology. If the presence of novel structure is established in vivo, this will stimulate further research of the physiological relevance of these structures. Furthermore, the proposed development of toughly characterized nanobodies targeting AGCGA-quadruplexes will provide a powerful tool for the scientific community. It should be also mentioned that so far, no structural data is available on antibody-noncanonical DNA and protein recognition of non-canonical DNA structures is extremely scarce and limited only to peptide models. A possible outcome of this project (nanobody-quadruplex crystal structures) will fill this gap and shed light on how can proteins recognize non-canonical DNA structures.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zgodovina ogledov
Priljubljeno