Projekti / Programi
Raziskave agregacije proteinov v vodnih raztopinah soli in drugih topnih dodatkov
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.04.01 |
Naravoslovje |
Kemija |
Fizikalna kemija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| P400 |
Naravoslovno-matematične vede |
Fizikalna kemija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.04 |
Naravoslovne vede |
Kemija |
Agregacija proteinov, vodne raztopine, razpad na dve tekoči fazi, vplivi dodatkov, Wertheimove teorije
Raziskovalci (18)
Organizacije (1)
Povzetek
Poznavanje interakcij med proteini v vodnih raztopinah, ob upoštevanju prisotnosti soli in drugih dodatkov, je za biologijo osnovnega pomena. Pod določenimi pogoji se proteini lahko združujejo v gruče. Pojav je odvisen od koncentracije proteina, temperature pa tudi od narave in množine dodatkov. Samozdruževanje (agregacija) proteinov ima lahko za posledico razpad raztopine na dve tekoči fazi, kristalizacijo ali pa nastanek amorfne oborine.
Tradicionalen način analize merskih podatkov za raztopine proteinov sloni na priredbi teorije, ki so jo postavili Derjaguin– Landau–Verwey–Overbeek, za raztopine koloidov. Tu so proteini predstavljeni kot toge kroglice, ki interagirajo s centralno-simetričnimi van der Walsovimi in elektrostatskimi interakcijami, kjer je topilo kontinuum, elektrostatika pa je ob prisotnosti soli upoštevana kot Debye-Huckelovo senčenje. Ta pristop v nekaterih primerih da pravilne odgovore glede na odvisnosti od pH in množine dodane soli, a nikakor ne more pojasniti efektov, ki so odvisni od narave soli, to je zakaj imajo različne soli tako različne sposobnosti obarjanja proteinov. Poleg tega ima anizotropija (interakcije niso centralno simetrične) ključen vpliv pri tvorbi agregatov saj vpliva na njihovo obliko in velikost. Koloidni modeli so torej nerealna slika dejanskega stanja v raztopini, še posebej pri protitelesih, ki imajo obliko črke Y. Alternativa so podrobne ("all atom") računalniške simulacije. Te znajo biti zelo koristne, saj nam omogočajo bolj podrobno sliko dogajanja, toda sistemi molekul, ki so relevantni za farmacijo in biologijo so pogosto preveliki za kvalitetne "all-atom" simulacije. Poleg tega ostaja problem izbire parametrov modela (force-field problem).
Za študij interakcij med proteini in posledične agregacije se nam trenutno zdi najbolj primeren poenostavljen (coarse-grained) pristop, ki pa mora biti veliko bolj realističen od teorije na nivoju DLVO. Tak pristop, osnovan na idejah fizike kondenzirane snovi, se je začel uveljavljati v zadnjem desetletju. Skupaj z drugimi smo predlagali preproste modele za agregacijo proteinov v raztopinah soli v vodi. Proteine smo ponazorili kot toge kroglice, kot ročke (dumb-bells) ali delce v obliki črke Y, posute z aktivnimi mesti ki med seboj interagirajo s privlačnim škatlastim potencialom. Le-ta ima pogosto globino in doseg reda velikosti vodikove vezi. V nasprotju s centralno simetričnimi modeli pa aktivna (vezavna ) mesta na površini omogočajo kotno odvisne interakcije med proteini. Na nizu primerov smo pokazali, da takšni modeli v povezavi z Wertheimovimi teorijami, omogočajo uspešno analizo merskih podatkov. Opogumljeni s prvimi razultati (in tudi odmevi kolrgov nanje) tu predlagamo: (i) nove fizikalno-kemijske modele raztopin proteinov, (ii) podrobno numerično ovrednotenje mnogih praktično pomembnih problemov, (iii) obsežno primerjavo s poskusi, mnoge bomo naredili sami v našem laboratoriju. Modelne raztopine proteinov bomo obravnavali z Wertheimovimi teorijami (TPT1 in/ali integralske enačbe. Raziskovali bomo agregacijo proteinov, fazne pretvorbe ki vodijo do ravnotežja med dvema tekočima fazama, drugi virialni koeficient, viskoznost raztopine, lastnosti vode ob površini proteina in še nekatere druge merljive količine. Hidratacija je glavna gonilna sila pri bioloških procesih kot so zvijanje proteinov, vezanje ionov, molekulsko prepoznavanje, agregacija in porazdelitev med različne faze. Z obravnavanjem vode kot enakovredne molekulske vrste (in ne le kot kontinuum) v sistemu protein-voda-elektrolit bomo bistveno bolj realistično zajeli fiziko solvatacije kot so jo dosedanji pristopi. Raziskovali bomo tako razredčene, glede na vsebnost vseh topljencev, kot tudi močno koncentrirane sisteme (razmere kot so v celici), ki jih sedaj intenzivno proučujejo. Teoretične rezultate bomo, kjerkoli bo to možno, primerjali z našimi lastnimi poskusi pa tudi z eksperimentalnimi podatki iz literature.
Pomen za razvoj znanosti
Dobršen del bioloških procesov je odvisen od proteinov, njihovih medsebojnih interakcij (tako parskih kot v obliki oligomerov), ki zavise od topila in prisotnih ligandov, kot so soli, polimeri in dodatki pomembni za formulacijo zdravil. Samozdruževanje proteinov v različne strukture je za biologijo bistvenega pomena, igra pa pomembno vlogo tudi v farmacevtski industriji. Razumeti želimo kako molekule proteina interagirajo z vodo, ioni, in med seboj. Tako bi lahko bolje razumeli biološke procese in pripravili bolj učinkovite zdravilne formulacije. Pred kratkim so ugotovili, da so mnoge celične funkcije povezane s ``kapljicami'' proteinov (membrane-less organelles), ki nastanejo pri razpadu raztopine na dve tekoči fazi, ki je predmet proučevanja tega projekta. Voda je kritičnega pomena za biologijo, saj sodeluje pri zvijanju proteinov, vezanju, agregaciji, porazdelitvi med fazami, in pri molekulskem prepoznavanju. Če vode ne upoštevamo dovolj realistično, nas tudi realističen opis drugih komponent v raztopini, ne pripelje do uporabnega rezultata. Na primer, če vodo obravnavamo le kot dielektrični kontinuum, iono-specifičnih pojavov sploh ne moremo pojasniti. Pomembno področje raziskav v farmacevtski industriji je formulacija in stabilizacija zdravil, ki sta tudi povezana s hidratacijo. Iz teh pa tudi še drugih razlogov, ki jih nismo omenili, potrebujemo boljše napovedi solvatacije za zapletene procese kot so: tvorba kompleksov in agregacija proteinov, njihovo obarjanje, kristalizacijo in tvorbo fibrilov, in situacije kjer dodana sol in drugi aditivi ključno vplivajo na interakcije med proteini. Upoštevati moramo tudi ključne sestavine potrebne pri formulaciji proteinskih zdravil (monoklonska protitelesa), kot so stabilizatorji (osmoliti in/ali nukleinske kisline). V naših raziskavah bomo vodo obravnavali na enakem nivoju približka, kot druge prisotne molekulske vrste in ne le kot kontinuum brez strukture. Na ta način bomo bolje kot dosedanji modeli zajeli fizikalno bistvo solvatacije. Ni dvoma, da je boljše razumevanje fizikalnih in kemijskih lastnosti mešanic proteinov in elektrolitov v vodi pomembno za boljše razumevanje za boljše razumevanje delovanja celice. Če upoštevamo pomen interakcij med proteini za široko področje bioloških znanosti smemo reči, da tudi majhen napredek pri razumevanju vedenja raztopin proteinov, pomeni pomemben dosežek.
Pomen za razvoj Slovenije
Much of biology depends on proteins interacting with each other, pairwise or in form of oligomers, mediated by water and different ligands, such as salts, polymers, and excipients needed for drug formulation. The self-assembly of proteins into various structures plays a crucial role in biology and is of great importance for pharmaceutical industry. We wish to understand how protein molecules interact with water, ions and in-between them, to better understand the biological processes and to perform a quality drug design. Recently, many cellular functions have been associated with membrane-less organelles (protein droplets), formed by liquid-liquid separation, one of the main thermodynamic properties to be studied in this project. Water is critically important in biology, mediating folding, binding, aggregation, partitioning and molecular recognition. If we do not account for water accurately, the results of even the otherwise accurate physical models may not provide realistic results. For example, modeling water as dielectric continuum cannot explain the salt-specific effects. An important arena of industrial research, connected to hydration, is formulating and stabilizing protein drugs. For these and other reasons not mentioned here, we need better solvation modeling for complex situations, where proteins bind other proteins to form specific complexes, where they aggregate, precipitate, crystallize or form fibrils and for situations, where salts and other additives are modulators of protein-protein interactions. We also need to include the key components of formulations of protein drugs (monoclonal antibodies), such as stabilizing excipients (osmolytes and/or amino acids). In the present project proposal, by treating water on equal level of approximation as other species present (and not merely as a structure-less continuum), we shall capture the hydration physics more realistically than previous theoretical approaches. There is no doubt that understanding the physical and chemical properties of mixtures of proteins with electrolytes in water is necessary for better understanding of cellular functions. Considering the importance of the inter-protein interactions for vast areas of biological science we believe that even small advancement in understanding of protein solutions represents a valuable achievement.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
