Projekti / Programi
Novi prognostični in diagnostični označevalci v razvoju raka debelega črevesa in danke
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.04.00 |
Medicina |
Onkologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B200 |
Biomedicinske vede |
Citologija, onkologija, kancerologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.02 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Klinična medicina |
rak debelega črevesa in danke, polipi, bioinformatska analiza, novi označevalci, funkcijska validacija
Raziskovalci (11)
Organizacije (3)
Povzetek
Cilji. Rak debelega črevesa in danke (RDČD) sodi med najpogostejše vzroke smrti zaradi raka. Kljub napredku se pri 40-50% bolnikov z RDČD pojavijo zasevki. Prognoza bolezni se je bistveno izboljšala od uvedbe presejalnega programa za RDČD, ki omogoča odkrivanje zgodnjih lezij, vključno z adenomom in zgodnjim karcinomom ter številnimi diagnostično problematičnimi polipi z nejasnimi lastnostmi. Čeprav so molekularne poti, ki so odgovorne za spremembo normalne sluznice v adenom, razmeroma dobro definirane, diagnostični označevalci za razlikovanje med dvoumnimi lezijami niso znani. Zato je nujno potrebno poiskati nove diagnostične in prognostične označevalce.
Hipoteza. Predpostavljamo, da:
s pristopi bioinformatike lahko odkrijemo nove diagnostične in prognostične označevalce;
se lahko novi označevalci uporabijo za napoved pojava lastnosti, ki so povezane z neugodnim potekom bolezni (npr. brstenje tumorjev, zasevanje, serozna invazija);
lahko nove označevalce uporabimo za razlikovanje med problematičnimi lezijami, npr. adenomom, adenomom s psevdoinvazijo in zgodnjim karcinomom;
številni novo odkriti označevalci so povezani s pomembnimi patogenetskimi mehanizmi pri RDČD, npr. epitelijsko-mezenhimskim prehodom, tumorskimi matičnimi celicami, organizacijo zunajceličnega matriksa, tumorsko heterogenostjo;
analiza izražanja in porazdelitve novih označevalcev lahko zagotovi nov vpogled v patogenezo RDČD in tako prispeva k iskanju novih terapevtskih ciljev.
Bolniki in metode. Izvedli bomo meta-analizo javno dostopnih podatkov izražanja genov in miRNA z mikromrežami in sekvenciranje ter metilacije, ki so bili analizirani na vzorcih normalne sluznice kolona, adenoma in karcinoma. Za vse projekte bodo izvorni podatki analizirani s programskimi paketi v R.
Za validacijo bodo vzorci biopsij izbrani retrospektivno, iz arhiva Inštituta za patologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Vključili bomo vsaj 240 vzorcev 135 bolnikov, z adenomom, adenomom s psevdoinvazijo, zgodnjim karcinomom in RDČD v različnih stadijih.
DNA in RNA bomo izolirali iz tkiv, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin (rezine, igelna ekstrakcija ali mikrodisekcija). Izražanje RNA bo potrjeno z uporabo qPCR, izražanje proteinov z uporabo imunohistokemije, metilacijski status bo potrjen z uporabo sekveniranja po Sangerju ali pirosekveniranjem. Statistična analiza podatkov bo izvedena s SPSS (Willcoxon Rank za parne vzorce, Mann-Whitney za neodvisne vzorce, Spearman za korelacije).
Za obetavne označevalce bomo mutacijski status in število kopij genov analizirali s sekveniranjem nove generacije. Surovi podatki bodo analizirani z uporabo ustreznih bioinformatskih algoritmov. Odkrite mutacije bomo nadalje potrdili s sekvenciranjem po Sangerju, spremembe v številu kopij pa s qPCR.
Z uporabo celičnih linij RDČD bo najbolj obetaven par miRNA-mRNA validiran z uporabo reporterskega testa. Izražanje najobetavnejšega markerja pa bomo utišali s siRNA, čemur bo sledilo testiranje viabilnosti, proliferacije, apoptoze in migracije celic ter analiza izražanja RNA (RNAseq) in proteinov (prenos western).
Pričakovani rezultati. Pričakujemo, da bomo našli nove označevalce, ki bi jih lahko uporabili za napovedovanje neugodnega poteka bolezni, kot tudi nove označevalce, ki bi jih lahko uporabili za razlikovanje med problematičnimi lezijami. To bi bilo v veliko pomoč pri izbiri optimalnega zdravljenja za vsakega bolnika. Pričakujemo, da bomo poglobili naše razumevanje patogenetskih mehanizmov, npr. epitelijsko-mezenhimskega prehoda, tumorskih matičnih celic, organizacije zunajceličnega matriksa in tumorske heterogenosti. Vsi ti mehanizmi pripomorejo k razvoju in napredovanju RDČD. Pričakujemo, da bo boljše razumevanje patogeneze RDČD v pomoč pri odkrivanju novih terapevtskih ciljev v prihodnosti.
Pomen za razvoj znanosti
Pomen za razvoj stroke
Z uporabo bioinformatike bi lahko določili nove mehanizme, ki bi omogočili boljše razumevanje napredovanja raka debelega črevesa in danke (RDČD) ter identifikacijo novih prognostičnih označevalcev (za tumorsko brstenje, serozno invazijo in zasevanje).
Identificirani novi označevalci bi bili lahko uporabni tudi pri razlikovanju dvoumnih lezij, da bolnikov ne bi po nepotrebnem izpostavljali določenim oblikam zdravljenja. Določitev seta ustreznih označevalcev bi bilo lahko tako uporabno pri rutinskih histoloških preiskavah odstranjenih lezij.
Razumevanje mehanizmov EMP (epitelijsko-mezenhimskega prehoda), ECM (zunajceličnega matriksa) in CSC (značilnosti matičnih celic) bi bil dodaten korak k razumevanju razvoja RDČD in intra-tumorske heterogenosti.
Poleg tega bi lahko vse to znanje pripeljalo do razvoja novih načinov zdravljenja. Na primer, preprečevanje ali obnavljanje procesa EMP in CSC pri RDČD lahko zmanjša možnost razvoja zasevkov, prepreči ponovitev tumorja in odpornost na terapijo. Poleg tega miRNA predstavljajo obetavne terapevtske tarče. Vnos miRNA z znižanim izražanjem ali zaviralcev izražanja miRNA bi lahko povrnilo ustrezno funkcijo miRNA, kar vodi do normalnega izražanja tarčnih genov. V literaturi lahko zasledimo kar nekaj raziskav z miRNA kot terapevtskimi tarčami.
Pomen za razvoj znanosti
Pričakujemo, da bo večina naših rezultatov izvirna. Meta-analize različnih podatkov o izražanju mRNA v povezavi z izražanjem miRNA in metilacijskim statusom normalne sluznice debelega črevesa, adenoma in karcinoma še nismo zasledili. Obsežne raziskave, ki so bile opravljene, opisujejo razvoj zasevkov in tumorskih brstov v CRC; vendar zanesljivih prognostičnih označevalcev še vedno ne poznamo. O mehanizmih, ki povzročijo v serozno invazijo pri CRC in intra-tumorsko heterogenost, je še veliko neodkritega. Obstaja le nekaj objavljenih raziskav o razlikovanje dvoumnih lezij (adenomov) in maligni transformaciji adenoma.
Poleg tega nismo zasledili nobene sistematične analize dobro uveljavljenih ali analize novo odkritih označevalcev EMT, ECM in CSC, ki bi preverila možen vpliv teh mehanizmov v maligni transformaciji adenoma, serozni invaziji in intra-tumorski heterogenosti.
Pomen za razvoj Slovenije
Relevance to the development of scientific field.
Using bioinformatics, new mechanisms could be identified leading to better understanding of progression of colorectal carcinoma (CRC) and the identification of new prognostic markers related to tumour budding, serosal invasion, metastases etc.
Identified new markers would be a useful tool to help to distinguish among ambiguous lesions to avoid unnecessary treatment. Determination of the set of appropriate markers would be helpful during routine histological examination of removed lesions.
New insights into the significance of EMT (epithelial-mesenchymal transition), ECM (extracellular matrix) and CSCs (carcinoma stem cells) would be another step towards understanding CRC cancerogenesis and intra-tumor heterogeneity.
Furthermore, all this knowledge might lead to the development of new treatment modalities. For example, prevention or reversing the EMT and CSC process in CRC might decrease the possibility of metastases development, prevent recurrence of tumour and resistance to therapy. Additionally, miRNAs are feasible therapeutic targets. The introduction of down-regulated miRNA or miRNA inhibitors of up-regulated miRNAs would restore the miRNA function leading to normal expression of target genes. There are already numerous studies using miRNAs as therapeutic targets.
Relevance to the development of science
We expect for the majority of our results to be original. Meta-analysis of different data on mRNA expression in relation to miRNA expression and methylation status of the normal colon mucosa, adenoma and carcinoma to the best of our knowledge has not be performed yet. Extensive research has focused on the development of metastases and tumour budding in CRC; however, reliable prognostic markers are still lacking. There is still much to discover about mechanisms leading to serosal invasion in CRC and intra-tumour heterogeneity. There are only few published studies on adenoma as ambiguous lesions, epithelial misplacement in adenoma and malignant transformation of adenoma.
Moreover, we were not able to find any systematically analysis of well-established markers or analysis of newly identified markers of the EMT, ECM and CSC to investigate possible contribution of these mechanisms to the malignant transformation of adenoma, serosal invasion and intra-tumor heterogeneity.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo
