Projekti / Programi
Rezistomi probiotičnih in starterskih kultur kot potencialni dejavnik tveganja za širjenje odpornosti proti antibiotikom
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.02.04 |
Biotehnika |
Živalska produkcija in predelava |
Predelava animalnih surovin |
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.02 |
Kmetijske vede in veterina |
Znanost o živalih in mlekarstvu |
starterske kulture, probiotiki, živilska veriga, odpornost proti antibiotikom, rezistom, mlečni izdelki, mlečnokislinske bakterije
Raziskovalci (15)
Organizacije (3)
Povzetek
Intenzivna uporaba antibiotikov v medicini, veterini in intenzivni reji živali je v preteklih 50-ih letih s seboj prinesla problem razvoja odpornosti proti antibiotikom (AR) pri patogenih mikroorganizmih in zmanjšanje učinkovitosti zdravljenja infekcij, kar je Svetovna zdravstvena organizacija razglasila za eno od največjih groženj za zdravje. Znano je, da geni za odpornost proti antibiotikom (ARG) lahko horizontalno prehajajo med bakterijami različnih vrst in da se patogene bakterije z AR pojavljajo vzdolž celotne agro-živilske verige. V preteklosti so že opozarjali na problem, da tudi komenzalne bakterije v živilski verigi lahko predstavljajo rezervoar za ARG, vendar do nedavnega še ni bilo na voljo tako naprednih in zmogljivih molekularnih metod in tehnologij, ki omogočajo razkrivanje celih bakterijskih genomov in mikrobiomov kompleksnih vzorcev, vključno z »rezistomom« - skupom vseh genov za AR, prisotnih v določenem okolju. V predlagani raziskavi se bomo osredotočili na bakterijske predstavnice starterskih kultur in probiotikov, ki jih namerno dodajamo v prehransko verigo, ter na njihova celotna genomska zaporedja (WGS) – bodisi javno dostopna bodisi tista, ki jih bomo pridobili v okviru predvidenih raziskav. Pri komercialnih ali lastnih bakterijskih izolatih, predstavnikih starterskih in probiotičnih kultur, bomo s sekvenciranjem nove generacije (tehnologija Illumina) pridobili WGS, s katerimi bomo obogatili javne podatkovne zbirke. V WGS že znanih ali pridobljenih v predlagani raziskavi, bomo s pomočjo primerjalne genomske analize identificirali (in silico) ARG, mutacije in mobilne elemente ter ugotavljali skladnost rezultatov in silico napovedovanja AR z rezultati fenotipskega ugotavljanja občutljivosti za izbrane antibiotike. Slednje je pomembno s stališča presojanja o naravi (intrinzična ali pridobljena) opažene fenotipske odpornosti in možnosti izboljšanja kriterijev (mejne MIC) za ugotavljanje AR pri mlečnokislinskih bakterijah in bifidobakterijah. Postavili in validirali bomo orodja, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo (PCR, qPCR), s pomočjo katerih bomo ciljano preiskovali rezistome izbranih probiotičnih izdelkov in fermentiranih živil, proizvedenih s komercialnimi starterskimi kulturami ali brez njih. Razen tega bomo izbrane vzorce živil preiskali z metagenomskim sekvenciranjem, s ciljem odkriti več tarčnih ARG in ugotoviti relativno zastopanost le-teh, ter oceniti prispevek dodanih probiotičnih in starterskih kultur k rezistomom preiskanih vzorcev živil. Pristop, predstavljen v prijavljenem projektu, ki vključuje in silico preiskovanje celih genomov komenzalnih bakterij, metagenomsko sekvenciranje kompleksnih vzorcev živil ter kvantitativno podporo s PCR v realnem času (qPCR), bo omogočil učinkovitejše odkrivanje ARG v različnih rezistomih, povezanih z živili, ter boljše ocenjevanje tveganja za prenos ARG vzdolž živilske verige. Tako bomo pokrili razkorak med preteklimi raziskavami, ki so temeljile na fenotipskem testiranju in detekciji omejenega števila bolj poznanih tarč, in med bodočimi, ko se bo po pričakovanjih uporaba najbolj zmogljivih orodij za metagenomske analize razširila tudi na področje varne hrane.
Pomen za razvoj znanosti
V okviru projekta bodo vpeljani novi pristopi ugotavljanja odpornosti proti antibiotikom (AR) (primerjalna genomika, rezistomski pristop), kar je pomembno s stališča raziskovalne odličnosti sodelujočih ustanov – Univerze v Ljubljani in NLZOH. Kljub trditvam, da ima živilska veriga ključno vlogo pri širjenju odpornosti na antibiotike, metagenomskih analiz namreč skorajda še niso uporabljali za preiskovanje živilskih sistemov. Bolj napredni pristopi se postopno uveljavljajo tudi na področju raziskav AR pri medicinsko pomembnih bakterijah, počasneje pa na področju komenzalnih bakterij. Nekateri pretekli veliki projekti v EU, med katerimi velja omeniti ACE-ART (6FP) - Assessment and critical evaluation of antibiotic resistance transferability in food chain (2004-2007) in ARBFOOD - Antibiotic resistance genes in food: Molecular identification and transfer between micro-organisms (2001-2004) so opozorili na problem komenzalnih bakterij v prehranski verigi kot rezervoarjev za AR, ampak takrat še ni bilo na voljo tako zmogljivih molekularnih metod, ki omogočajo razkrivanje celih bakterijskih genomov in mikrobiomov kompleksnejših vzorcev, vključno s hrano. V projektni prijavi smo se osredotočili na bakterijske predstavnice starterskih kultur in probiotikov, ki jih namerno dodajamo v živilsko verigo, ter na njihove celotne bakterijske genome – bodisi javno dostopne bodisi tiste, ki jih bomo pridobili v okviru predvidenih raziskav. Bolj celovit pristop k odkrivanju AR pri predstavnicah starterskih kultur in probiotikov, ki ga bomo uporabili v predlagani raziskavi in bo temeljil na in silico analizah celih genomov in prepoznavanju genetskih determinant, povezanih z odpornostjo proti antibiotikom, bo omogočil učinkovitejše odkrivanje ter boljše ocenjevanje tveganja za prenos ARG vzdolž živilske verige. Metode in orodja, ki bodo ustrezno validirani tudi na vzorcih iz živilske verige (starterske in probiotične kulture, živila, probiotični izdelki…), bodo koristne tudi za druge raziskovalce. Razen tega bomo v javne zbirke prispevali nova genomska zaporedja izbranih predstavnic mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij,ki jih bodo v svojih raziskavah lahko uporabili tudi drugi raziskovalci.
V predloženi program smo vključili tudi pristop z najbolj naprednimi orodji – s takoimenovanim metagenomskim “shotgun” sekvenciranjem celotnih mikrobiomov oziroma ciljanim metagenomskim sekvenciranjem celotnih rezistomov z uporabo zadnje generacije platform, razvitih prav za analize rezistomov. V okviru finančnih možnosti tega razpisa sicer ne bo mogoče vključiti velikega števila vzorcev, bomo pa pokrili razkorak med preteklimi raziskavami, ki so temeljile na fenotipskem testiranju in detekciji omejenega števila bolj poznanih tarč, in med bodočimi, ko se bo po pričakovanjih uporaba najbolj zmogljivih orodij za metagenomske analize razširila tudi na področje varne hrane, saj bo postala bolj dostopna.
Pomen za razvoj Slovenije
New approaches to assessment of antibiotic resistance (AR) (comparative genomics, resistome approach), will be implemented in the frame of this project, which is important from the standpoint of research excellence of participating institutions - the University of Ljubljana and NLZOH. Despite the claim that the food chain plays a key role in the spread of antibiotic resistance, metagenomic analysis has scarcely been used to investigate food systems. More advanced approaches have recently been introduced also in the field of AR in medically important bacteria, and more slowly for commensal bacteria. Some previous EU projects, such as ACE-ART (6FP) - Assessment and critical evaluation of antibiotic resistance transferability in food chain (2004-2007) and ARBFOOD - Antibiotic resistance genes in food: Molecular identification and transfer between micro-organisms (2001-2004) drew attention to the problem of commensal bacteria in food chain as reservoirs for AR, but at that time, the high-throughput molecular methods that allow disclosure of whole bacterial genomes and microbiomes of complex samples including food have not yet been available. In this project proposal we focused on the representatives of bacterial starter cultures and probiotics, which are intentionally added to the food chain, and their whole genomic sequences (WGS) - either publicly available or those that will be obtained in this study. More comprehensive approach towards detection of AR in the representatives of starter cultures and probiotics, which will be based on in silico analysis of WGS and the identification of genetic determinants associated with AR, will enable efficient detection of these features in different resistomes associated with the food chain, and better assessment of the risk of transmission of ARGs along the food chain. Methods and tools which will be appropriately validated also on the samples from the food chain (starter and probiotic cultures, food, probiotic products ...) will also be useful for other researchers. In addition, we will contribute to the public databases new genomic sequences of selected representatives of lactic acid bacteria and bifidobacteria, which can be used in research by other researchers.
Approach with the most advanced tools - the so called full metagenomic "shotgun" sequencing of entire microbiomes or targeted metagenomic sequencing of the entire resistomes using last generation capture platforms specifically developed to analyze resistomes – have also been included in the proposed program. Considering the financial frame of this call, we will not be able to include a large number of samples, but we expect to cover the gap between previous studies, which were based on phenotypic testing and detection of a limited number of well-known targets, and among those in the coming years, when the use of the most powerful tools for metagenomic analyses is expected to spread well into the food safety area, as it will become more accessible.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo
