Loading...
Projekti / Programi vir: ARRS

Uporaba malega proteina bakteriofaga v boju proti razvoju odpornosti proti antibiotikom pri bakteriji Staphylococcus aureus

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
4.06.04  Biotehnika  Biotehnologija  Mikrobna biotehnologija 

Koda Veda Področje
T490  Tehnološke vede  Biotehnologija 

Koda Veda Področje
3.04  Medicinske in zdravstvene vede  Medicinska biotehnologija 
Ključne besede
antibiotiki, odpornost proti antibiotikom, virtualno rešetanje, adjuvant antibiotikov, Staphylococcus aureus, bakteriofag, odziv SOS
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (21)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacij
1.  24290  dr. Matej Butala  Biokemija in molekularna biologija  Vodja projekta  2019 - 2022  224 
2.  53672  Sandra Cetin  Farmacija  Raziskovalec  2021 - 2022 
3.  23399  dr. Tomaž Curk  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2019 - 2022  237 
4.  15284  dr. Stanislav Gobec  Farmacija  Raziskovalec  2019 - 2022  796 
5.  35424  dr. Tomaž Hočevar  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2019 - 2022  26 
6.  53283  Maja Hostnik  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2020 - 2022  11 
7.  52386  Eva Kočar  Biokemija in molekularna biologija  Tehnični sodelavec  2019 - 2020  19 
8.  25435  dr. Janez Konc  Računalniško intenzivne metode in aplikacije  Raziskovalec  2019  221 
9.  00412  dr. Igor Križaj  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  694 
10.  53699  Amela Kujović  Biokemija in molekularna biologija  Tehnični sodelavec  2019 - 2020  16 
11.  18802  dr. Adrijana Leonardi  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  139 
12.  39099  dr. Katja Molan  Biokemija in molekularna biologija  Mladi raziskovalec  2019  30 
13.  55449  Martina Mravinec  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2021 - 2022 
14.  39090  dr. Anastasija Panevska  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  45 
15.  51231  Anja Pavlin  Biokemija in molekularna biologija  Mladi raziskovalec  2019 - 2022  21 
16.  06902  dr. Zdravko Podlesek  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2020 - 2022  137 
17.  52376  Matic Proj  Farmacija  Mladi raziskovalec  2019 - 2022  51 
18.  04570  dr. Jože Pungerčar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  318 
19.  15328  dr. Kristina Sepčić  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  695 
20.  52378  Nika Strašek  Farmacija  Mladi raziskovalec  2020 - 2022 
21.  21553  dr. Jernej Šribar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2019 - 2022  106 
Organizacije (4)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacij
1.  0106  Institut "Jožef Stefan"  Ljubljana  5051606000  84.952 
2.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  64.093 
3.  0787  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo  Ljubljana  1626973  16.888 
4.  1539  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za računalništvo in informatiko  Ljubljana  1627023  14.335 
Povzetek
Razvoj odpornosti proti antibiotikom med bakterijami je posledica prekomerne uporabe antibiotikov za zdravljenje infekcij. Uspešno zdravljenje bakterjskih infekcij je resno ogroženo zaradi neučinkovitega razvoja novih proti-mikrobnih učinkovin. V zednjih trideset letih ni na tržišču novih razredov antibiotikov. Posledično, nujno potrebujemo nove pristope in načine zdravljenja patogenov odpornih proti večini v kliniki uporabljenih antibiotikov. Adaptacija bakterij proti antibiotikom je posledica specifičnih biokemijskih procesov, ki bi lahko bili tarče učinkovin. Preprečitev bakterij, da razvijejo odpornost proti antibiotikom bo znatno podaljšalo uporabnost obstoječih antibiotikov. To bomo dosegli z inovativnim pristopom, z novimi učinkovinami, ki blokirajo prilgoditev bakterij na stres povzročen z antibiotiki. Antibiotiki sprožijo poškobe DNA in inducirajo odziv SOS v patogenih bakterijah, s tem (i) vplivajo na evolucijo in razširitevr determinant odpornosti proti antibiotikom med bakterijami, (ii) sprožijo nastanek mutacij v bakterijah, (iii) sprožijo nastanek sevov tolerantnih na antibiotike in sprožijo (iv) tvorbo biofilma ter (v) sintezo toksinov. Pomembnost odziva SOS nakazuje na dejstvo, da imajo inhibitorji tega odziva velik potencial v medicini saj bi lahko z njimi preprečili razvoj odpornosti proti antibiotikom s tem, da inhiramo procese evolucije v bakterijah. V kolikor inhibiramo samo cepitev regulatorja LexA, poglavitnega regulatorja odziva SOS, bakterije občutno v nižji meri razvijejo odpornosti proti genotoksičnim antibiotikom in znatno znižajo nivo mutageneze.  Naravni produkti, ki jih sintetizirajo mikroorganizmi so priviligirane mlolekule za razvoj učinkovin proti bakterijam saj so rezultat milijonov let selekcije in so vir izredno učinkovitih antibiotikov. V naših nedavnih objavah smo opisali mali protein bakteriofaga GIL01 bakterije Bacillus thuringiensis, protein gp7. Gp7 gradi 50 aminokislinskih ostankov in interagira s proteinom LexA bakterij ter uravnava funkcije LexA. To je prvi opis naravnega produkta, ki direktno interagira z LexA in inhibira samo-cepitev LexA ter izboljša interakcijo LexA-DNA, torej inhibira odziv SOS. Pridobili smo kristalno strukturo proteina gp7 in na podlagi podatkov analize SAXS izdelali strukturni model proteina gp7 v kompleksu s proteinom LexA. Na podlagi struktur bomo razvili učinkovine, ki z visoko afiniteto vežejo LexA, ki bodo osnova za razvoj varnih “proti-evolucijskih” terapevtikov, ki bodo uporabljeni v kombinaciji z antibiotiki v boju proti infekcijam povzročenih s sevi Bacillus sp. in Staphlococcus aureus. Izboljšali bomo naše znanje o lastnostih proteina gp7 in vitro in na globalnem nivoju v bakterijah Bacillus in Staphylococcus sp. Pridobili bomo boljši vpogled v procese, ki jih nadzira protein gp7, kar je ključno za razvoj varnih učinkovin, ki temeljijo na proteinu gp7. Nadalje, uporabili bomo virtualno rešetanje s kljižnicami malih molekul in na podlagi lastnosti proteina gp7 izbrali učinkovine, ki inhibitorno delujejo proti LexA bakterij Bacillus sp. in S. aureus. Tako bomo pridobili učinkovine vodnice proti odzivu SOS skaterimi bomo blokirali procese, ki vodijo v razvoj odpornosti proti antibiotikom. Določili bomo ravnotežne konstante disociacije za interakcije vodnice-LexA in ovrednotili njihov vpliv na potenciiranje delovanja antibiotikov preko sledenja razvoja odpornosti proti antibiotikom v sevih Bacillus sp. in S. aureus. Pričakujemo, da bodo optimizirane učinkovine vodnice/derivati proteina gp7 v kombinaciji z antibiotiki prispevale v boju proti razvoju odpornosti med bakterijami in podaljšali učinkovitost obstoječih antibotikov.
Pomen za razvoj znanosti
Svetovna znanstvena organizacija (SZO) je pozvala k takojšnjemu skupnemu boju proti pojavu superbakterij, odpornih na antibiotike. Na trg je potrebno pripeljati nove razrede antibiotikov, da preprečimo smrtnost zaradi infekcij, ki smo jih že desetletja uspešno zdravili, dokler niso zaradi pojava odpornosti postala trenutna zdravila neuporabna. Partnerstvo med industrijo in akademskim svetom (GlaxoSmithKline) je nekaj mesecev nazaj odkrilo prve za LexA specifične male molekule, ki inhibirajo njegovo samo-cepitev in kot prve spadajo v čisto nov razred zdravil. To odkritje potrjuje uporabnost LexA, kot nove antibakterijske tarče, ki bi jo lahko izrabili v boju proti pojavu odpornosti na antibiotike. Njihova strategija je bila razviti učinkovine, ki tarčno ciljajo na mesto samo-cepitve LexA. Ker pa so v aktivnem mestu LexA, okoli cepitvene zanke, že prisotne visoke koncentracije substrata je katalitična domena LexA zahtevna tarčna za kompetitivno inhibicijo. Zaradi teh omejitev, je učinkovina, ki so jo razvili avtorji (njihov članek je bil ravnokar sprejet) šele po izboljšavah dosegla še vedno visoko IC50 vrednost 9 µM za LexA iz E. coli. Iz tega je razvidno, da so kljub vloženega veliko dela, potrebne še nadaljne optimizacije, ki bi lahko privedle do učinkovitega inhibitorja.   V tem projektu predstavljamo drugačen in inovativen pristop k razvoju LexA inhibitornih učinkovin, na podlagi lastnosti naravnega proteina gp7 in razumevanja strukture kompleksa LexA-gp7 iz naših še neobjavljenih rezultatov. Razvili bomo učinkovite alosterične inhibitorje LexA, za katere predvidevamo, da bodo delovali vsaj na LexA iz Bacillus sp. in S. aureus. Naš pristop je inovativen zaradi uporabe gp7, kot ogrodja za razvoj derivatov gp7 ali malih spojin vodnic, ki stabilizirajo LexA v DNA vezavni konformaciji in obrnejo cepitveno zanko LexA v konformacijo, ki onemogoča cepitev. S takimi konformacijskimi spremembami LexA ni več zmožen interagirati z RecA in z RecA posredovana samo-cepitev LexA je tako onemogočena. V prejšnjih študijah smo že dokazali, da gp7 prepreči interakcijo med LexA in RecA, ter da na DNA vezan LexA ne more biti inaktiviran. Tukaj tako predstavljamo obetaven nov pristop k razvoju unikatnih zdravil, ki preprečijo pojav antibiotskega stresa in razvoj odpornosti pri bakterijah in tako podaljšajo učinkovitost antibiotikov, ki so že v uporabi.   Poleg tega želimo preučiti vpliv gp7 na bakterijske procese pri B. thuringiensis in S. aureus na ravni genoma. Ti izsledki bodo pomembni za razumevanje vpliva gp7 in vivo in rezultati teh študij zanesljivo interesantni za širšo znanstveno skupnost. ChIP-chip analize izvedene v E. coli so pokazale, da je za vezavo LexA na neohranjena zaporedja in vivo potreben dodatni faktor (Wade in sod., Genes Dev. 2005). Ti podatki nakazujejo, da obstajajo gp7 podobni LexA efektorji tudi v drugih bakterijah, ti pa bi lahko zagotovili ogrodja za močne učinkovine za boj proti razvoju rezistence pri izbranih patogenih. Naša projektna prijava lahko tako odpre nov razred antibiotikov prihodnosti.? ?
Pomen za razvoj Slovenije
World Health Organisation called for an urgent and concerted action: »Combat drug resistance: no action today means no cure tomorrow.« We need to bring new classes of antibiotics to market to prevent people from dying from infections that have been treatable for decades, until resistance rendered our drugs ineffective. An academic-industry parthership has just few months ago reported the first LexA-targeting small molecules. Given the fact that GlaxoSmithKline entered such collaborative effort that lead to the identification of first-in-class inhibitors of LexA self-cleavage confirms the importance of recognising LexA as a novel, potent antibacterial drug target to address the rising tide of antibiotic resistance bacteria. However, they used an approach in which they targeted the LexA self-cleavage reaction. They observed that by hitting directly the catalytic domain of LexA makes it a difficult target for competitive inhibiton, given the high local concentration of the cleavage loop »substrate« around the LexA active site. Thus, only after refeiment of the certain chemotype targeting LexA the authors (their article has been just accepted) could  reach the IC50 value down to 9 µM for the E. coli LexA. This indicates, that although great effort was allready invested, even further optimisation is needed which might result in an efficient inhibitor. Here we propose a different and unique approach based on the natural gp7 protein characteristics and on our unpublished structural LexA-gp7 insight. We will design an effective allosteric inhibitors of LexA that we predict will target at least LexA of Bacillus sp. and S. aureus. Our approach is novel in that gp7 will be used as a scafold to design gp7 derivatives or small lead molecules that stabilize LexA in a DNA bound conformation and additionaly orient LexA cleavage site loop in the non-clavable state, thus firmly inhibiting repressors`s self-cleavage by precluding LexA to interact with RecA. It is of note that we have previously shown that gp7 inhibits LexA to interact with RecA and that DNA bound LexA cannot be inactivated. Thus, here we offer a promissing novel approach to design unique drugs that block antibiotic stress and resistance development in bacteria, prolonging the efficiency of licensed antibiotics. In addition, we want to elucidate gp7 effect on processes in B. thuringiensis and S. aureus on the genome wide-scale. This is important to understand the gp7-effects in vivo and the results will surely be of great interest to the broad scientific commnity. In E. coli, ChIP-chip approach revealed that an additional factor is required for LexA binding to noncanonical sites in vivo (Wade et al., Genes Dev. 2005). Thus, we strongly believe that gp7-like LexA effectors exist also in other bacteria which could provide scafolds for potent drugs against antibiotic-resitance development in selected pathogens. Thus, our project proposal may open up a novel class of tomorrow`s antibacterials.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Vmesno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno