Projekti / Programi
Razvoj anti-FREM2 nanotelesa in njegova uporaba pri ciljanju glioblastomskih celic.
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.03.00 |
Medicina |
Nevrobiologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B000 |
Biomedicinske vede |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
Glioblastom, FREM2, nanotelesa, gliomageneza, citotoksičnost
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
38279 |
dr. Ivana Jovchevska |
Biokemija in molekularna biologija |
Vodja |
2019 - 2022 |
87 |
Organizacije (1)
Povzetek
Glioblastom je najbolj pogosta oblika možganskega tumorja, ki ima v večini primerov smrtne posledice. Kljub večtirnemu in agresivnemu zdravljenju, ki je sestavljeno iz maksimalne kirurške odstranitve tumorja in nadaljnje kemoterapije s temozolomidom ter obsevanja, povprečna življenjska doba pacientov po diagnozi dosega 12 do 18 mesecev. Klinično zdravljenje je oteženo zaradi genetske raznolikosti glioblastoma. Obe glavni skupini, IDH divji tip in IDH mutiran, se odlikujeta z različnimi genetskimi spremembami. Poleg tega je genetska tipizacija določila tri molekularne podtipe (klasični, pronevralni in mezenskimski), ki imajo svoje določene genetske odtise in so lahko hkrati prisotni v enem tumorju. Raziskovalci poskušajo določiti tudi bio-označevalce glioblastoma, a še vedno nobena od identificiranih molekul (CD133, EGFR/EGFRvIII, IGHG1, IL-6) ni pokazala zadostne specifičnosti. Trenutno se raziskujejo različne alternativne metode kot so dostava zdravil preko nosne votline, virusne terapije in klinični poskusi na osnovi protiteles. Edinstvena nekonvencionalna metoda za identifikacijo molekulskih sprememb je uporaba laminih težko-verižnih nanoteles. Nanotelesa so najmanjši vezavni fragmenti z izjemnimi lastnostmi: majhna velikost, visoka stabilnost v nefizioloških pogojih, topnost v vodi in ekonomična proizvodnja. Zaradi specifične oblike njihovega antigen-vezavnega fragmenta lahko nanotelesa prepoznajo epitope, ki so trenutno nevidni za klasična protitelesa. Zaradi tega so primerna za identifikacijo novih tarč.
V predhodni raziskavi smo identificirali FRAS povezani zunajcelični matriks protein 2 – FREM2 kot protein z diferenčnim izražanjem v glioblastomskih celičnih linijah v primerjavi z nemalignimi astrociti. Dodatno smo opazili zanimivo izražanje proteina na površini glioblastomskih celic, česar pa nismo videli pri kontrolah. Nato smo pokazali, da se FREM2 diferenčno izraža v človeških glioblastomskih tkivih v primerjavi z gliomi nižje stopnje in referenčnimi vzorci. Analiza TCGA podatkov je pokazala povišano izražanje FREM2 gena z napredovanjem bolezni. Dodatno smo našli pozitivno korelacijo med ravnjo izražanja FREM2 gena in ponovnim pojavom bolezni. Za potrditev naših ugotovitev o specifičnosti FREM proti glioblastomskim celicam nameravam razviti nanotelo proti temu antigenu. Za ta namen bom uporabila že obstoječo knjižnico nanoteles. Po izbiri nanotelesa bom potrdila njegovo specifičnosti proti FREM proteinu s kombinirano imunofluorescenco z uporabo nanotelesa in komercialnega protitelesa proti istemu antigenu. Za oceno učinka anti-FREM2 nanotelesa na glioblastomskih celicah bom izvedla različne teste. Z imunofluorescenčno mikroskopijo v realnem času bom dokazala, da je nanotelo sposobno vstopati v glioblastomske celice. Ker je protein FREM2 vpleten pri migraciji celic, bom izvedla test celjenja rane, z namenom vrednotenja sposobnosti nanotelesa za zaviranje migracije glioblastomskih celic. Nadalje bom testirala kakšen vpliv ima nanotelo na celično viabilnost. Nazadnje bom ustvarila celično linijo, ki je odporna na temozolomid, saj domnevamo, da je FREM2 vpleten v ponovno rast tumorja. Vrednotila bom vpliv, ki ga ima anti-FREM2 nanotelo na glioblastomske celice, ki so odporne na temozolomid ter določila raven izražanja gena FREM2 v glioblastomskih celicah v prisotnosti in brez temozolomida.
S tem delom pričakujem, da bom pridobila nanotelo z visoko specifičnostjo in afiniteto za ciljni protein – FREM2. V naši prejšnji raziskavi smo pokazali vpletenosti FREM2 v patologiji glioblastoma. Zdaj bi želela potrditi rezultate prejšnjih raziskav z različnimi funkcionalnimi testi. S predlagano študijo bom pridobila nove podatke o malignem napredovanju glioblastoma in vlogi, ki jo FREM2 igra pri tem.
Pomen za razvoj znanosti
Glioblastom predstavlja velik problem moderne družbe zaradi pozne diagnoze in agresivne narave, ki vodita do visoke smrtnosti. Ker standardne molekularno-biološke metode niso dosegle značilnega napredka na tem področju, raziskovalci razmišljajo “out of the box”, da bi rešili ta problem.
FREM2 je zanimiva tarča za razvoj mehanizmov ciljanja zaradi selektivnega površinskega izražanja v glioblastomskih celicah. Pridobljeno anti-FREM2 nanotelo bi lahko v nadaljevanju razvili kot biološko nano-zdravilo v primeru, da bo pokazalo selektivni toksični učinek za glioblastomske celice v primerjavi z nemalignimi astrociti. Razvoj nanotelesa proti FREM2 bo koristno pri ciljanju glioblastomskih celic. Pridobljeno nanotelo bi lahko uporabili kot nosilec oziroma za prenos citotoksičnih sredstev do specifičnih podskupin celic. Predlagana raziskava bo odprla tudi možnosti za nadaljnjo preučevanja mehanizma prenosa nanoteles preko celične membrane.
Zaradi majhne velikosti se predvideva, da lahko nanotelesa prečkajo krvno-možgansko pregrado in imajo večji dostop do možganskega tkiva. To pomeni, da bi lahko nanotelesa razvili kot orodja za spremljanje in/ali diagnosticiranje možganskih patologij in vivo. V laboratorijih, pa bi se lahko uporabljala pri ne-invazivnih diagnostičnih metoda kot je ELISA. Za uporabo v klinični praksi bo potrebno temeljito preučiti njihovo farmakokinetiko. Čeprav je majhnost nanoteles prednost za diagnozo, lahko pri zdravljenju postane omejitev, saj njihovo hitro izločanje iz telesa pomeni, da bo za sistemsko terapijo potrebno precej pogosto doziranje. Pri lokalni administraciji te omejitve ne bi bilo.
Kljub možnim omejitvam so najpomembnejše značilnosti nanoteles njihov naravni izvor in nizka imunogenost. S predlagano inovativno raziskavo bomo pridobili nove podatke o patologiji glioblastoma. Pričakujem, da bom s to študijo ugotovila ali je FREM2 primeren kandidat, da bi ga naprej razvijali kot bio-označevalec glioblastoma. Dodatno bom s preučevanjem razlik med obdelanimi in neobdelanimi celicami s temozolomidom pridobila informacije ali je FREM2 vključen v napredovanje bolezni.
Hitro napredovanje bolezni in visoka smrtnost izkazujeta veliko potrebo po razvoju novih metod zdravljenja. Navkljub naraščajočemu številu objav na področju “bio-označevalcev raka”, še vedno ne obstaja niti ena molekula, ki bi se lahko uporabljala kot univerzalni označevalec glioblastoma. Terapevtske metode je treba razviti v smeri ciljanja določene podskupine celic (kot so rakave matične celice) ali celične lastnosti, ki je ključnega pomena za razvoj tumorja. Da bi zmanjšali škodo na okoljskem tkivu, je potrebna identifikacija specifičnih bio-označevalcev glioblastoma, ki bi se lahko uporabljali za razvoj ciljanjih metod zdravljenja, kar bo sčasoma izboljšalo nego pacientov in pričakovano življenjsko dobo.
Pomen za razvoj Slovenije
Because of the late diagnosis and aggressive nature which lead to a high mortality rate glioblastoma is a big problem of today’s society. As standard molecular biology methods have not yielded significant improvements in this field, researchers are thinking out of the box to solve the problem.
The antigen FREM2 is an attractive target for development of targeting mechanisms due to its surface expression in glioblastoma cells. After determining the specificity of the nanobody towards its antigen and examining its toxic effect on glioblastoma cells over non-malignant astrocytes, the obtained anti-FREM2 nanobody can be further developed into a biological nano-drug. Developing a nanobody against FREM2 can be useful for targeting glioblastoma cells. Furthermore, the obtained nanobody can also be used as a carrier i.e. to transport a cytotoxic agent to a specific cell type. This research will also open the possibility to explore the mechanism of how nanobodies are transported across the cell membrane.
Because of the small size, nanobodies are expected to pass the blood brain barrier and have greater access to brain tissue. This means that nanobodies can be developed as tools for monitoring and/or diagnosis of brain pathologies in vivo. In laboratories, nanobodies can be used in non-invasive diagnostic techniques such as ELISA. However, for use in clinical practice the pharmacokinetics of nanobodies has to be thoroughly studied. Although their small size is an advantage for diagnosis, it can become a limitation during treatment. Namely, due to the fast excretion, if nanobodies are used in systemic therapy they will require frequent administration. Still, in cases of local drug administration this problem will not be encountered.
Besides the potential limitations, the most important nanobody features for use with human subjects are their natural origin and low immunogenicity. This innovative research will give novel insight into glioblastoma pathology. I expect that the proposed study will show whether FREM2 is a suitable protein to be further evaluated as a glioblastoma bio-marker. Additionally, by examining differences between temozolomide-treated and non-treated glioblastoma cells we can obtain information whether FREM2 is involved in the advancement of the pathology.
The fast progression and high mortality rate of glioblastoma only emphasize the urge for developing novel treatment methods. Despite the growing number of publications on “cancer bio-markers”, there is no single molecule that can be used as a universal marker for the disease. Therapeutic methods should be developed in the direction of targeting a specific subset of cells (for example cancer stem cells) or a cellular characteristic that is crucial for tumor development. For minimizing damage on adjacent tissue, identification of specific glioblastoma bio-markers is necessary for development of targeted therapeutic approaches which will eventually lead to improvement in patient care and life expectancy.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo
