Projekti / Programi
Strukturna karakterizacija faktorjev, ki sodelujejo pri popravljanju kovalentnih povezav DNA-protein
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.06 |
Naravoslovne vede |
Biologija |
Poškodba DNK, kovalentna povezava DNK-protein (DPC), popravljalni mehanizmi DPC, rak, staranje, SPRTN proteaza, p97 AAA ATPaza, ACRC/GCNA protein, krio-elektronska mikroskopija, X-žarkovna kristalografija, strukturne raziskave
Raziskovalci (10)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
55098 |
Maksimiljan Adamek |
Biokemija in molekularna biologija |
Tehnični sodelavec |
2021 - 2022 |
18 |
| 2. |
55978 |
Primož Bembič |
Biokemija in molekularna biologija |
Tehnični sodelavec |
2023 - 2024 |
5 |
| 3. |
31814 |
Urška Dečko |
|
Tehnični sodelavec |
2020 - 2021 |
3 |
| 4. |
50722 |
Luka Kavčič |
|
Tehnični sodelavec |
2022 - 2024 |
29 |
| 5. |
38255 |
dr. Andreja Kežar |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2020 - 2024 |
42 |
| 6. |
35382 |
dr. Matic Kisovec |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2020 - 2024 |
80 |
| 7. |
55663 |
Tanja Peric |
|
Tehnični sodelavec |
2021 - 2024 |
4 |
| 8. |
12048 |
dr. Marjetka Podobnik |
Biokemija in molekularna biologija |
Vodja |
2020 - 2024 |
316 |
| 9. |
38473 |
Tomaž Švigelj |
|
Tehnični sodelavec |
2020 - 2022 |
11 |
| 10. |
21684 |
Tea Tomšič |
|
Tehnični sodelavec |
2020 |
2 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
20.942 |
Povzetek
Kovalentno povezovanje med DNA in proteini (angl. DNA-protein crosslink, DPC) je vrsta poškodbe DNA, pri kateri se protein pod vplivom notranjih ali zunanjih faktorjev nepovratno kovalentno veže na DNA. Med notranje spodbujevalce DPC spadajo produkti normalne celične presnove, kot so reaktivne kisikove vrste, aldehidi ali spremembe v helični zgradbi DNA, med zunanje faktorje pa uvrščamo UV svetlobo, ionizirajoče sevanje in različne nevarne kemikalije. DPC so pogoste poškodbe DNA, ki predstavljajo fizično blokado vseh procesov na DNA, kot so podvajanje, prepisovanje, rekombinacija in popravljanje. Če jih mehanizmi v celici ne popravijo, DPC lahko privedejo do nestabilnosti genoma in razvoja patoloških fenotipov, kot so prezgodnje staranje, nevrodegeneracija in rak. Ker se do nedavnega popravljanje kovalentnih povezav DNA-protein (DPCR) ni štelo kot ločeno pot popravljanja poškodb DNA, so kljub pogostnosti in resnim posledicam DPC, ti mehanizmi danes še slabo preučeni. V letih 2014 in 2016 je več raziskovalnih skupin identificiralo nove proteaze, Wss1 v kvasovkah in SPRTN pri sesalcih, ki sodelujejo pri odstranitvi DPC preko proteolitične razgradnje proteinov, zamreženih na DNA. Odkritje s proteolizo-sklopljenih mehanizmov popravljanja DNA je vodilo do spoznanja, da DPCR poteka ločeno od kanoničnih poti popravljanja poškodb DNA, vendar pa je o strukturnih značilnostih in molekularnih mehanizmih tega tipa popravljanja le malo znanega. Do danes so strukturne informacije o DPC in faktorjih, udeleženih v njegovo popravljanje, omejene le na del SPRTN, ki vsebuje aktivno mesto encima. Študije na kvasovkah so pokazale, da bi SPRTN lahko deloval v povezavi s p97, ATP-odvisno segregazo iz družine AAA ATPaz, ki je poglavitno udeležena v procese DPCR. Poleg tega smo vzporedno z drugimi odkrili še eno domnevno proteazo, ACRC (tudi GCNA), ki vsebuje SPRTN-podobno katalitično domeno. Kljub temu je še vedno malo strukturno znanega o interakciji SPRTN s substrati DPC in segregazo p97 kot tudi biokemijskih ter strukturnih informacijah o ACRC, morebitni novi proteazi, vključeni v DPCR. Cilj študije so (1) karakterizirati kompleks SPRTN:p97 in ACRC in vitro in in vivo ter (2) rešiti tridimenzionalne strukture človeških kompleksov SPRTN:DPC in SPRTN: p97 ter proteina ACRC z uporabo krio-elektronske mikroskopije (krio-EM) ter X-žarkovne kristalografije. Komplekse proteina SPRTN z modelom DPC in p97 bomo pripravili in vitro. Za proizvodnjo homogene populacije DPC bomo uporabili adukte Ogg1-DNA, ki jih je mogoče ustvariti z visoko učinkovitostjo in vitro. Za določitev strukture visoke ločljivosti, predvsem za komplekse z večjo stopnjo fleksibilnosti, bomo uporabili najnovejšo metodologijo krio-EM, pri čemer bomo meritve opravili na krio-elektronskem mikroskopu s fazno ploščo in neposrednim detektorjem elektronov. Za reševanje strukture ACRC bomo zaradi majhnosti proteina uporabili X-žarkovno kristalografijo. Predlagana raziskava bo razkrila molekularne mehanizme, na katerih temelji DPCR. Pridobljeno znanje bo predvidoma bistveno vplivalo na razumevanje teh procesov, saj imajo inhibitorji p97 in SPRTN vedno bolj pomembno vlogo pri zdravljenju raka in staranju. Projekt bosta izvajali tesno povezani raziskovalni skupini, ena z Inštituta Ruđer Bošković, Hrvaška, druga pa s Kemijskega inštituta v Sloveniji. Raziskovalci si delijo skupno raziskovalno zanimanje za boljše razumevanje in opis molekulskih interakcij ter mehanizmov bioloških procesov, med drugim tudi za proteolizo ter opis interakcij med proteini ter proteini in nukleinskimi kislinami. Skupni raziskovalni interesi in strokovno znanje bodo zelo pomembni za uspeh tega projekta. Poleg tega je ključni faktor za uspeh projekta tudi komplementarnost med skupinami v smislu metodoloških pristopov kot tudi prenos znanja med sodelujočima mednarodnima skupinama.
