Projekti / Programi
Molekularni mehanizmi toksičnosti listeriolizina
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| P310 |
Naravoslovno-matematične vede |
Beljakovine, encimologija |
| P340 |
Naravoslovno-matematične vede |
Lipidi, steroidi, membrane |
| B110 |
Biomedicinske vede |
Bioinformatika, medicinska informatika, biomatematika, biometrija |
| B120 |
Biomedicinske vede |
Molekularna biofizika |
Listeria monocytogenes, Listerioza, listeriolizin, lipidne membrane, pH odvisnost, holesterol, ciljana mutageneza
Raziskovalci (5)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
15686 |
dr. Gregor Anderluh |
Biokemija in molekularna biologija |
Vodja |
2007 - 2009 |
968 |
| 2. |
27751 |
Andrej Bavdek |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2007 - 2009 |
30 |
| 3. |
30203 |
Aleksander Kocuvan |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
2009 |
28 |
| 4. |
06994 |
dr. Peter Maček |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2007 - 2009 |
523 |
| 5. |
12278 |
dr. Maja Rupnik |
Mikrobiologija in imunologija |
Raziskovalec |
2007 - 2009 |
684 |
Organizacije (2)
Povzetek
Naravni toksini so izjemno pomembne molekule, ki omogočajo interakcije organizmov z okoljem. Razumevanje njihovega delovanja na molekularnem nivoju je izjemno pomembno v medicini, varovanju zdravja, bazičnih in aplikativnih znanostih. V tem projektu bi radi študirali nekatere lastnosti molekularnega mehanizma delovanja listeriolizina O (LLO). LLO je bakterijski toksin, ki poruši integriteto celičnih lipidnih membran. Je najbolj pomemben virulenčni dejavnik intracelularne po Gramu pozitivne bakterije Listeria monocytogenes, ki povzroča listeriozo, resno bolezen, ki se prenaša s hrano. Glavna naloga LLO je, da omogoči pobeg iz fagosomov v citoplazmo. LLO je član družine proteinov, ki izkazujejo holesterolno specifičnost delovanja. Od ostalih članov družine se razlikuje po tem, da ima optimum delovanja v kislem pH območju. Z vrsto biokemijskih in biofizikalnih pristopov bi radi razvozljali kakšen je mehanizem holesterolne in pH odvisnosti. Uporabljali bomo divji tip LLO in različne variante, ki jih bomo pripravili kot rekombinantne proteine v heterolognem ekspresijskem sistemu v E. coli. Osrednja tehnika, ki jo bomo uporabljali bo površinska plazmonska resonanca, pomembna biokemijska metoda, ki so jo pri študiju interakcij proteinov z membranami pričeli uporabljati šele v zadnjih nekaj letih. Pričakujemo, da bomo opisali holesterolno in pH specifičnost LLO na molekularnem nivoju, t.j. kateri deli molecule in katere aminokisline omogočajo ti dve pomembni lastnosti LLO. Znanja, ki jih bomo pridobili bodo imela globji pomen za razumevanje patogenosti listerioze in, na splošno, specifično prepoznavanje lipidov s proteinskimi domenami. Tvorila pa bodo tudi dobro osnovo za razvoj terapevtikov in molekularnih orodij v celični biologiji.
Pomen za razvoj znanosti
Listeriolizin je glavni virulenčni dejavnik patogene bakterije Listeria monocytogenes, ki povzroča resno bolezen listeriozo. Listeriolizin je član proteinske družine od holeterola odvisnih citolizinov, ki v membranah tarčnih celic tvorijo velike pore. Listeriolizin se od drugih članov družine razlikuje po tem, da bolje deluje v kislem pH območju, kar omogoča pobeg bakterije iz fagolizosoma v citosol, kjer se lahko razmnožuje in širi v sosednje celice. Raziskovalni projekt nam je omogočil opis odvisnosti listeriolizina od pH in kako je delovanje listeriolizina kontrolirano v citosolu gostiteljske celice. Pokazali smo, da pH ne vpliva bistveno na aktivnost proteina, saj je hemolitska aktivnost in sposobnost tvorbe por ohranjena pri fiziološkem pH. Listeriolizin postane neaktiven šele po nekajminutni inkubaciji pri višji temperaturi, nad 37 °C, medtem ko pri nižjem pH ne agregira. Agregacija listeriolizina, ki smo jo opisali v projektu je najpomembnejši mehanizem njegove inaktivacije, ki poteče ob prehodu v citosol celice. S strukturnimi metodami smo pokazali, da je listeriolizin pri nižjem pH v obliki dimera, kar ima verjetno pomembno vlogo pri preprečevanju agregacije. V projektu smo tudi razvili presejalni test za inhibitorje agregacije, ki ga bomo uporabili pri iskanju majhnih molekul, ki bi lahko specifično preprečevale agregacijo listeriolizina. Projekt nam je tudi omogočil opisati dele molekule, ki so pomembni za funkcijo proteina, predvsem tiste, ki vplivajo na vezavo na lipidne membrane in hemolitsko aktivnost. Naša študija je dala tudi dobra izhodišča za uporabo bakterijskih toksinov v celični biologiji, saj smo pokazali, da se da družino bakterijskih toksinov, kamor uvrščamo listeriolizin, uporabiti kot orodja v celični biologiji. Z metodo površinske plazmonske resonance smo pokazali, da se predstavnike teh toksinov da uporabiti za detekcijo holesterola v membranah. V prihodnosti bo tako možno študirati ali se proteini, ki specifično prepoznavajo lipide prisotne v lipidnih raftih, tudi porazdeljujejo v te domene na površini celic in kako sestava lipidnih membran vpliva na prisotnost holesterola in njegovo izpostavljenost za vezavo s proteini.
Pomen za razvoj Slovenije
Za Republiko Slovenijo so rezultati projekt koristni zaradi več nivojev. Tekom projekta smo omogočili šolanje in trening raziskovalcev, ki uporabljajo moderne tehnologije in metode. V projektu so sodelovali tako dodiplomski kot podiplomski študenti, ki so uporabljali vrhunsko tehnologijo, ki je na razpolago v laboratorijih glavnega raziskovalca projektne skupine in sodelavcev v tujini, kjer se je projekt tudi izvajal. Znanje, ki so ga pridobili jim bo nedvomno koristilo na njihovi bodoči poklicni poti. Projekt nam je tudi omogočil razvoj novih raziskovalnih metod in pristopov v biokemiji lipidnih membran. V projektu smo razvili metodo površinske plazmonske resonance za spremljanje interakcije proteinov in membran in tako omogočili boljše kompetitivne prednosti slovenske znanosti. Pristop je relativno nov v znanosti in samo nekaj skupin je, ki ga v popolnosti izkorišča. Skupina za biokemijo in vodja projekta postajata vedno bolj izkušena pri študijah interakcij proteini-membrane z metodo površinske plazmonske resonance, kar se izkazuje tudi z vabili na konference in k pripravi preglednih člankov. Z objavami v visoko citiranih mednarodnih znanstvenih revijah, s predavanji na mednarodnih kongresih in akademskih institucijah in z organizacijo mednarodnih znanstvenih srečanj je projektna skupina pomembno prispevala k uveljavitvi slovenske znanosti v svetu, predvsem na področju biofizikalnih pristopov v bazičnih znanostih.
Raziskave, ki so potekale tekom projekta so bazičnega značaja, vendar imajo določeno aplikativno vrednost. Znanje, ki smo ga pridobili tekom projekta, bo koristilo pri načrtovanju novih terapevtikov, saj je listeriolizin glavni virulenčni dejavnik bakterije Listeria monocytogenes. Z opisom vezavnega mesta za holesterol bomo lahko lažje načrtovali označevalce za lipidne domene, ki bi jih lahko uporabili v celični biologiji. Metodologija in eksperimentalni pristopi, ki jih bomo razvili tekom projekta bodo takoj na voljo uporabnikom iz akademskih inštitucij in industrije. Še posebej velja to za pristop površinske plazmonske resonance, ki bo zanimiv za širšo znanstveno javnost v Sloveniji in tudi v sosednjih državah.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
