Projekti / Programi
Mehanizem in diagnostika replikacije prionov
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.03.00 |
Medicina |
Nevrobiologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
prioni, konformacija, replikacija, diagnostika, fluorescenca, nevroblastomi, celične kulture
Raziskovalci (9)
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
20.982 |
Povzetek
Prenosljive spongiformne encefalopatije (TSE), imenovane tudi prionske bolezni, so posebna oblika nalezljivih obolenj, kjer infektivni agens predstavlja spremenjena konformacija prionskega proteina. S projektom nameravamo odgovoriti na eno ključnih vprašanj pri razumevanju prionskih bolezni in sicer katere konformacijske spremembe so povezane s prenosljivostjo bolezni ter preizkusiti nov pristop za detekcijo konformacijskih sprememb prionskega proteina (PrP) v celicah. Inventivna ideja projektne skupine je omejiti zmožnost konformacijske pretvorbe na določenih predelih strukture mišjega PrP z uvedbo dodatnih disulfidnih povezav na izbranih mestih v strukturi. Tako bomo neposredno preizkusili temelj prionske hipoteze in ugotovili kateri predeli strukture so ob pretvorbi ohranjeni in kateri se spremenijo. Načrtujemo, da bomo identificirali mutante, ki bodo odporne na pretvorbo v patološko obliko. Določili bomo biofizikalne lastnosti izoliranih mutant ter s pomočjo NMR visoke ločljivosti določili strukturne značilnosti izbranih mutant. Sposobnost podpiranja infektivnosti in njeno inhibicijo bomo preizkusili tudi v nevroblastomskih celičnih linijah in liniji z izbitim genom za PrP. Detekcija TSE v zgodnji asimptomatski fazi je zelo zahtevna vendar izjemno pomembna za preprečitev razširjanja bolezni s transplantacijami, transfuzijo krvi in s prehrano ter bo olajšala potencialno zdravljenje. Danes se kot metoda detekcije TSE uporablja bodisi zasledovanje PrP, odpornega na proteolizo, kar zazna šele pozno obliko bolezni ali test na glodalcih, ki pa je dolgotrajen in zahteva veliko število nepotrebno žrtvovanih živali. Kot alternativa se kaže test na celičnih linijah (SCA), kjer pa doslej nismo mogli razlikovati med vnesenim in pretvorjenim prionom. Nameravamo preizkusiti nov pristop zasledovanja konformacijske spremembe PrP, kateremu bomo proteinu dodali tetracisteinske peptidne oznake (PrP-C4), na katere se lahko tudi v živih celicah veže reagent FlAsH. Fluorescenca tega kompleksa je odvisna od konformacije proteina in bi lahko omogočila spremljanje konformacijske pretvorbe PrP znotraj celic. Tudi v tem primeru bomo izvedli meritve fibrilizacije izoliranih proteinov in v celičnih linijah spremljali pretvorbo v realnem času, kar bo lahko osnova za novo platformo detekcije infektivnosti. Rezultati raziskav bodo omogočili nov vpogled v mehanizem pretvorbe prionskih proteinov in potencialno tudi zaščito pred TSE, hkrati pa tudi novo platformo za detekcijo infektivnosti.
Pomen za razvoj znanosti
Kljub intenzivnemu raziskovanju na področju prionskih bolezni še vedno ni znano, kakšna je struktura patološke oblike prionskega proteina. S pomočjo načrtovanih disulfidnih mostičkov, ki so povezali izbrane elemente sekundarne strukture prionskega proteina, smo določili predele PrP, podvržene konformacijski spremembi. V nasprotju z drugimi modeli PrPSc naši rezultati nakazujejo, da se večina v celični obliki prisotnih elementov sekundarne strukture tekom konformacijske spremembe ohrani. Študije in vitro so podprte tudi z rezultati na celičnih modelih prionskih bolezni. Določitev strukture patološke oblike je pomembna tudi pri načrtovanju potencialnih terapij za te smrtne bolezni. Pokazali smo, da se kurkumin specifično veže na patološke oblike prionskega proteina, ne pa tudi na normalno obliko PrP. Poleg vezave kurkumina na strukture PrP z visokim deležem beta sekundarne strukture, kurkumin prepozna tudi v kislem nastajajoči intermediat - delno odvito alfa obliko PrP. Gre za prvi objavljeni prikaz vezave spojine naravnega izvora na delno odvito obliko PrP. Pokazali smo tudi specifično vezavo kurkumina na plake rezin možganov umrlega vCJB. Poleg inhibitornega delovanja bi bili kurkumin in njegovi bolj stabilni derivati primerni tudi za zaživljenjsko diagnostiko prionskih bolezni. Tekom projekta smo razvili tudi nove reagente za diagnostiko prionskih bolezni. Objavili smo nov postopek sinteze biarzinskih spojin, ki se specifično vežejo na tetracisteinsko oznako. Tetracisteinsko oznago smo uvedli v mišji prionski protein in razvili metodo za detekcijo konverzije PrP, ki ne uporablja razgradnje s proteinazo K. Pokazali smo tudi specifično označevanje PrP s tetracisteinsko oznako v celičnih kulturah.
Pomen za razvoj Slovenije
Tekom projekta smo intenzivno sodelovali z najboljšimi evropskimi skupinami na področju prionskih bolezni. Poleg izmenjave idej je naša študentka obiskala laboratorij dr. Ine Vorberg (TUM), kjer se je naučila rokovati s celičnimi modeli prionskih bolezni. Dodatno se je pri tem naučila pripravljati stabilne celične linije s pomočjo retrovirusov, kar nameravamo izkoristiti tudi na drugih področjih naših raziskav. V ta namen smo obnovili in registrirali nekaj laboratorijev 2. varnostne stopnje na našem oddelku.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
