Projekti / Programi
Priprava podprtih lipidnih membran z encimi za razvoj biosenzorjev
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.02.07 |
Naravoslovje |
Fizika |
Biofizika |
| Koda |
Veda |
Področje |
| P250 |
Naravoslovno-matematične vede |
Kondenzirane snovi: struktura, termične in mehanske lastnosti, kristalografija, fazno ravnovesje |
| P260 |
Naravoslovno-matematične vede |
Kondenzirane snovi: elektronska struktura, električne, magnetne in optične lstnosti, supraprevodniki, magnetna rezonanca, relaksacija, spektroskopija |
| P300 |
Naravoslovno-matematične vede |
Analitična kemija |
| P340 |
Naravoslovno-matematične vede |
Lipidi, steroidi, membrane |
| B120 |
Biomedicinske vede |
Molekularna biofizika |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
lateralna heterogenost lipidnih membran, holesterol, podprte membrane, na membrano vezani proteini, lipidno-proteinske interakcije, biosenzorji, acetilholinesteraza
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
20208 |
dr. Zoran Arsov |
Biotehnologija |
Vodja |
2007 - 2008 |
135 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0106 |
Institut "Jožef Stefan" |
Ljubljana |
5051606000 |
90.742 |
Povzetek
Odlaganje lipidnih vesiklov na trdne podlage je privlačen in enostaven način za pripravo podprtih lipidnih membran. Pričakujemo lahko, da lateralna heterogenost lipidnih membran vpliva na nastanek podprtih membran. Zlivanje vesiklov, ki je osnovni proces pri tvorbi podprtih dvojnih plasti, je namreč odvisno od strukture membran lipidnih vesiklov. Lateralna heterogenost je prisotna v bioloških in modelnih membranah. V bioloških membranah so lipidne in proteinske molekule razporejene v lateralne domene, v modelnih membranah pa pride pri ustrezni sestavi in temperaturi do fazne separacije.
Z odlaganjem membranskih vesiklov lahko pripravimo tudi podprte membrane z vključenimi proteini, ki lahko služijo kot biološki zaznavni element v biosenzorjih. S pritrditvijo na membrano vezanih proteinov preko podprtih membran se izognemo potrebi po izolaciji, čiščenju in rekonstituciji proteinov, ki lahko privedejo do denaturacije ali deaktivacije. Trenutno je razvoj biosenzorjev omejen predvsem na uporabo vodotopnih proteinov, katerih izolacija ne vpliva na njihovo delovanje, medtem ko bi uporaba podprtih membran pospešila tudi uporabo na membrano vezanih proteinov.
Glavni namen predlaganega projekta je ugotovitev primernih pogojev za pripravo podprtih lipidnih membran z odlaganjem vesiklov glede na ugotovljeno lateralno heterogenost v teh vesiklih. Da bi poudarili pomen priprave podprtih membran za razvoj biosenzorjev na osnovi na membrano vezanih proteinov, bomo pripravili podprte eritrocitne membrane z vključenim encimom acetilholinesterazo in preverili delovanje tega encima.
Možna uporaba biosenzorjev na osnovi encima acetilholinesteraze vključuje nadzor vsebnosti organofosfatnih pesticidov in insekticidov v živilih in v okoljskih vzorcih kot tudi spremljanje splošne varnosti ljudi ter uporabo v vojaške/anteroristične namene preko zaznavanja živčnih strupov.
Pomen za razvoj znanosti
Rezultati projekta bodo prispevali k razumevanju nastanka in možne uporabe podprtih lipidnih membran brez proteinov kot modelnih sistemov, oziroma podprtih membran z vključenimi proteini pri razvoju biofunkcionaliziranih površin.
Najprej je pomembno razumevanje lateralne heterogenosti v lipidnih membranah zaradi njenega vpliva na samoureditvene procese pri nastanku podprtih membran z odlaganjem vesiklov, npr. zlivanje in pretrganje vesiklov. Pri študiju membranske heterogenosti sta bila v okvira projekta narejena dva pomembna koraka naprej. Pri delu z elektronsko paramagnetno resonanco (EPR) smo pokazali, da lahko z razvojem posebnih algoritmov za avtomatsko obdelavo eksperimentalnih spektrov povečamo učinkovitost pridobivanja informacij o strukturi membran. Poleg tega smo prednosti infrardeče spektroskopije na atenuiran totalni odboj (ATR-FTIR metoda) pred običajno transmisijsko metodo izkoristili za izvajanje poskusov na podprtih membranah v presežku vode, kar je privedlo do novih spoznanj, saj so se dosedaj poskusi večinoma izvajali na membranah hidratiranih v vlažni atmosferi. Uspeli smo tudi pokazati prednosti hkratne uporabe obeh metod na enakih vzorcih. Rezultati tega dela projekta prispevajo k poznavanju faznih diagramov za modelne lipidne membrane. Ti fazni diagrami so pomembni, ker s spreminjanjem sestave membran lahko vplivamo na delež posameznih lipidnih faz. Razvoj metodologije je zelo pomemben tudi za raziskovanje lateralne strukture bioloških membran, saj jo je možno uporabiti brez velikih prilagoditev.
Posebej bi izpostavili rezultate študija medmolekularnih interakcij z ATR-FTIR. Ugotovili smo, da pride do direktne interakcije med holesterolom in karbonilno oziroma amidno skupino preko tvorbe vodikove vezi, kar je eden redkih eksperimentalnih dokazov za obstoj te interakcije. Ti rezultati prispevajo k razjasnitvi enega največjih problemov membranske biofizike, t.j. problema stabilizacije lateralne strukturiranosti membran.
Z mikroskopijo na atomsko silo (AFM) smo potrdili domneve, da sestava membrane oziroma delež različnih lipidnih faz vpliva na lastnosti podprtih membran. Če torej najprej določimo lastnosti neke membrane, lahko napovemo njeno obnašanje pri tvorbi podprtih membran. Poleg tega smo pokazali uporabnost metode vrstične infrardeče mikroskopije z bližnjim poljem (SNIM) za topografsko in kemijsko karakterizacijo podprtih membran, s čimer smo naredili pionirske korake pri uporabi te metode za študij podprtih membran. Zelo pomemben je tudi prispevek pri ugotavljanju možnosti za pripravo modificiranih trdnih podlag za pripravo nanostrukturiranih podprtih membran. Odkritja, ki jih lahko prinese to delo, so izjemnega pomena za aplikacijo podprtih membran pri razvoju biosenzorjev.
V okviru projektu smo tudi pokazali način priprave podprtih membran, ki vključujejo na membrano vezane proteine oziroma encime. Take funkcionalizirane površine je možno uporabiti kot biološke zaznavne elemente za biosenzorje. Ugotovili smo, da lahko nastanek podprte eritrocitne membrane z vključenim encimom acetilholinesterazo (AChE) spremljamo s površinsko plazmonsko resonanco. Pomen eritrocitne AChE je v njeni podobnosti z AChE, ki se nahaja v živčnih sinapsah. Rezultati so zelo pomembni za področje razvoja biosenzorjev na osnovi membranskih proteinov, saj je trenutno razvoj biosenzorjev omejen predvsem na uporabo vodotopnih proteinov.
Pomen za razvoj Slovenije
Rezultati projekta bodo prispevali k razumevanju odvisnosti nastanka podrtih membran od njihove strukture. Razumevanje in poznavanje postopkov za pripravo podprtih membran z vključenimi proteini bo omogočilo uporabo na membrano vezanih proteinov pri razvoju biosenzorjev ter s tem vplivalo na dosego različnih družbeno-ekonomskih ciljev. Eden od takih ciljev je tehnološki razvoj, saj izdelava oziroma razvoj biosenzorjev sodi v visokotehnološko proizvodnjo merilnih in diagnostičnih pripomočkov. Kot primer navedimo biosenzorje za spremljanje nivoja sladkorja v krvi diabetičnih bolnikov, ki so v svetu doživeli uspešno komercializacijo.
Biosenzorji, ki delujejo na podlagi encima acetilholinesteraze (AChE), imajo pomen za naslednja področja: nadzor in skrb za okolje, varstvo človekovega zdravja, varnost in obramba. S takimi biosenzorji namreč lahko zaznamo prisotnost strupenih in nevarnih snovi v vodi, hrani in okolju, kot so npr. pesticidi, insekticidi ali živčni plini. Uporaba bi omogočila dvig kvalitete življenja, saj bi lahko npr. nadzorovali kvaliteto živil, kar je ena od prioritet slovenske raziskovalne politike.
Rezultati glede možne modifikacije trdnih podlag za pripravo nanostrukturiranih podprtih membran so pomembni na področju razvoja nanomaterialov. V zadnjem času zelo napredujejo metode oblikovanja vzorcev na površinah na mikro in nanoskali. S kontroliranim odlaganjem različnih vesiklov z različnimi encimi na strukturirane in modificirane podlage bi lahko pripravili strukturirane podprte membrane. Le-te bi lahko postale del načrtovanih prizadevanj na področju razvoja biosenzorjev, ki gredo v smeri razvoja prenosnih multianalitskih in multiencimskih biosenzorjev.
Pri izvajanju projekta smo se povezovali z različnimi institucijami v Sloveniji, s čimer smo pripomogli k prenosu in posredovanju različnih znanj. Tako smo v sodelovanju z Oddelkom za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, uporabili komercialno dostopne zlate podlage za pripravo podprtih eritrocitnih membran z AChE, katerih nastanek smo ovrednotili z metodo površinske plazmonske resonance. Poleg tega so bile aktivnosti na projektu predstavljene v Laboratoriju za raziskave v okolju, Univerza v Novi Gorici, ter na Kliničnem institutu za klinično kemijo in biokemijo, Klinični center Ljubljana. Glavni namen predstavitev je bilo posredovanje različnih znanj s področja uporabljene metodologije ter iskanje možnosti za sodelovanje.
Pri izvajanju projekta smo sodelovali z mladimi raziskovalci in mladimi doktorji znanosti iz različnih področij, saj je bil projekt zastavljen interdisciplinarno. S tem smo posredno vplivali na povečanje usposobljenosti mladih strokovnjakov, ki bodo v prihodnosti s svojim znanjem dopolnili ekspertne sisteme v zdravstvu, visokošolskih in raziskovalnih ustanovah, farmacevtski industriji ter visokotehnoloških podjetjih na področju biotehnologije, s čimer bi lahko posredno prispevali k trajnostnemu razvoju slovenske družbe.
Zelo pomemben del projekta so predstavljala tudi sodelovanja s partnerji iz tujine: Sinhrotron v Trstu, Italija, Inštitut za biofiziko in raziskave nanosistemov Avstrijske akademije znanosti, Gradec, Avstrija, in Ruhr-univerza v Bochumu, Nemčija. Sodelovanje je omogočilo pridobitev novih praktičnih znanj ter prenos znanja v Slovenijo.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
