Projekti / Programi
Bioinženiring adaptivne mutacije pri bakteriji Escherichia coli
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.06.00 |
Biotehnika |
Biotehnologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
adaptivna mutacija, naravni genetski inženiring, dvo-komponentni regulatorni sistem PhoP-PhoQ, magnezij, Ebg operon, mobilni genetski elementi, insercijsko zaporedje IS30, alternativni sigma faktor RpoS, stacionarna faza, izražanje genov, bioinženiring, verižna reakcija s polimerazo v realnem času - Q-PCR, inhibitorji sistema za zaznavanje kvoruma, optimizacija biosinteze, Escherichia coli K-12, neodarvinizem, evolucija
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
21417 |
dr. Rok Krašovec |
Biokemija in molekularna biologija |
Vodja |
2007 - 2009 |
31 |
Organizacije (1)
Povzetek
Adaptivna mutacija je eden od sistemov naravnega genetskega inženiringa, s katerimi celica kontrolirano spreminja lasten zapis DNA. Adaptivna mutacija je zaradi sajenja dvoma v neodarvinistično evolucijsko teorijo, kjer naravna selekcija izbira zgolj med naključnimi mutacijami, zelo pomemben mejnik današnje znanosti. Doktorska disertacija, ki je raziskovala povezavo med okoljem in adaptivnimi mutacijami v bakteriji Escherichia coli je dokazala, da okoljski magnezij spreminja frekvenco adaptivnih mutacij. Že v disertaciji smo domnevali, da magnezij ne deluje tako kot mutagene spojine tipa etidijev bromid, za katere je značilno da neposredno poškodujejo verigo DNA. Delovna hipoteza se tako glasi, da okoljski magnezij inducira adaptivne mutacije preko vpliva na aktivnost bakterijskega dvo-komponentnega regulatornega sistema PhoP-PhoQ, ki je v E. coli dokazano zadolžen za preskrbo z magnezijem.
Skozi predstavljeni podoktorski projekt nameravamo pridobiti novo temeljno znanje, ki bo ovrglo ali potrdilo delovno hipotezo, ki v sebi nosi za znanost in kasnejšo uporabno sfero silno pomembno vprašanje: »Ali obstaja povezava med sistemom PhoP-PhoQ in mehanizmom adaptivne mutacije?«. Domnevno povezavo med komunikacijskim aparatom in adaptivno mutacijo nameravamo preveriti s sodobno cenovno ugodno molekulsko metodo imenovano verižna reakcija s polimerazo v realnem času (Q-PCR), s katero bomo merili izražanje štirih tarčnih genov phoP, phoQ, rpoS in ORF-A (gen kodira protein transpozazo insercijskega zaporedja IS30) v času nastajanja adaptivnih mutacij. Meritve relativnega izražanja genov bomo predvidoma izvedli v okolju z magnezijem, kalcijem, manganom in železom. Za naštete elemente je znano, da vplivajo na aktivnost dvo-komponentnega regulatornega sistema PhoP-PhoQ. Prav tako nameravamo izvesti meritve v okolju z elementi, ki na aktivnost PhoP-PhoQ dokazano ne vplivajo in opraviti druge obvezne negativne ter pozitivne kontrole. Z izvedbo številnih navzkrižnih poskusov bomo nedvoumno potrdili ali ovrgli delovno hipotezo.
Pridobljeni rezultati bodo imeli visoko temeljno znanstveno vrednost, saj je razumevanje evolucije izjemnega pomena za biološko znanost. Še vedno se namreč ne ve dovolj o zakonitostih mutacij, ki danes veljajo za glaven vir bioloških novosti. Eksperimentalne metode bioinženiringa so zanesljiv način, s katerim se lahko pridobi vpogled v biološke procese in predstavljen projekt bo eden prvih, ki bo najnovejše znanje in metodologijo bioinženiringa vpeljal v raziskovanje evolucijskih procesov in mehanizmov, ki jih vodijo. Hkrati bomo naredili nujen korak naprej v razumevanju biološkega zaznavanja okoljskih signalov v času stradanja, kar je silno pomembno za realen uvid v vedenje bakterij v naravi. Namreč, z Q-PCR nameravamo spremljati tudi izražanje gena rpoS, ki kodira globalen regulator stradanja in je ključen faktor za diferenciacijo celic v bolj odporno obliko imenovano stacionarna faza. Naši rezultati bodo tako pripomogli k še boljšemu razumevanje celične regulacije tega za bakterije silno pomembnega proteina. Prav tako se moramo zavedati, da mnogo za človeka pomembnih snovi, sintetizirajo in izločajo le stacionarne celice. Pridobljeni podatki bodo tako pomembni tudi za optimizacijo biosinteznih procesov, za katere se pogosto uporablja prav E. coli. Raziskava ima tudi visoko uporabno vrednost, saj je aktivnost sistema za zaznavanje kvoruma (SZK) bistvena za virulenco mnogih človeku, živalim in rastlinam nevarnih bakterij. V luči alarmantnega povečanja odpornosti mikrobov na antibiotike, eksperimentalno preverjeno dejstvo da inhibicija SZK zavira virulenco, postavlja inhibicijo SZK kot najbolj obetavno protimikrobno strategijo prihodnosti, ki ima realno možnost da postane nova vodilna metoda zdravljenja bakterijskih infekcij. Rezultati naše raziskave bodo namreč zvišali razumevanje interakcij med okoljskimi signali in mikrobnimi celicami v času stresa, kar bo zelo koristno za razvoj učinkovitih inhibitorjev SZK. Prav ta
Pomen za razvoj znanosti
Dejstvo je, da bakterije magnezij zaznavajo s senzorno kinazo PhoQ ter da prekinitev gena phoP ali phoQ značilno zniža frekvenco adaptivnih mutacij. A očitno je, da različen nivo izražanja phoQ in phoP, ki ga dosežeš z različno koncentracijo magnezija v okolju, nima nekega linearnega učinka na pojavljanje adaptivne mutacije. Za prekinitev gena ebgR zadošča že konstitutivno izražanje phoP in phoQ in že to je pomembna ugotovitev. Pomembna in presenetljiva ugotovitev naloge je, da ima celična gostota očitno pomembno in še ne razumljeno vlogo pri adaptivni mutaciji. Kakšna je v resnici, bodo pokazali nadaljnji poskusi ter posvetovanja z drugimi raziskovalnimi skupinami. A nekaj je jasno že zdaj, rezultat je ponovljiv in stabilen, eksperimentalna napaka je presenetljivo nizka, kar kaže, da je v ozadju zakonitost in ne zgolj naključje. Tretja ugotovitev pomembna za znanost pa je spoznanje, da moramo razumevanje adaptivnih mutacij iskati v kompleksnem sistemskem pristopu. Teorija kompleksnosti na primer zelo pronicljivo razlaga izvor rakastih celic in je po mojem mnenju tudi zelo dobra podlaga za razumevanje ozadja adaptivnih mutacij. Vse te ugotovitve skupaj s temeljito argumentacijo pripravljam v obliki znanstvenega članka, ki bo zelo kmalu poslan v priznano mednarodno znanstveno revijo.
Pomen za razvoj Slovenije
Raziskovanje na podoktorskem projektu me je pripeljalo do marsikaterih spoznanj, ki sem jih uredil v smiselno celoto. Produkt tega razmisleka bo kvaliteten članek v že izbrani mednarodni znanstveni reviji, ki bo zaobjel vse moje preteklo trdo delo in nakazal smernice za raziskovanje adaptivne mutacije v prihodnosti. Adaptivno mutacijo eksperimentalno raziskujem vsaj sedem let in imam zelo širok nabor podatkov. Raziskavo sem skozi ta leta zelo široko zastavil, se ogromno naučil in spoznal kaj pomeni biti vodja znanstveno-raziskovalnega projekta. Vse te izkušnje ter socialno mrežo, ki sem jo zgradil ob raziskovanju, bom uporabil v dobrobit razvoja slovenske znanosti tudi v prihodnje.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
