Projekti / Programi
MOLEKULARNI MEHANIZEM PRTEPOZNAVANJA DVOVERIŽNE RNA VIRUSOV PREKO TLR3
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
Tollu podoben receptor 3; naravna imunost; dvoverižna RNA; virusna infekcija; utišanje z RNA; molekularno modeliranje; vezalno mesto
Raziskovalci (6)
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
20.996 |
Povzetek
Naravni imunski odgovor je ključnega pomena za obrambo našega telesa proti patogenim mikroorganizmom. Prepoznavanje molekularnih vzorcev sestavin, ki so značilne za patogene mikroorganizme (PAMPs), kot so: lipopolisaharidi, flagelin ali dvoverižna RNA (dsRNA) poteka preko izvenceličnih (ekto)domen TLR receptorjev. TLR3 receptor se aktivira ob vezavo na dsRNA, ki je značilna za viruse ter inducira produkcijo interferonov tipa I.
Trenutni model aktivacije TLR3, ki predvideva prepoznavanje RNA preko mesta okoli aminokislinskih ostankov H539 in N541 ni zadovoljiv, ker ne pojasnjuje zakaj celic ne aktivirajo tudi kratki fragmenti siRNA.
V naši hipotezi predvidevamo, da ektodomena TLR3 receptorja vsebuje poleg že znanega še sekundarno mesto za vezavo RNA, ki se nahaja na ohranjenem N-terminalnem segmentu izvencelične domene, bogate z levcini. Predpostavljamo, da je za aktivacijo potrebno, da stimulirajoča RNA premosti razdaljo med dvema mestoma na ecdTLR3, ki delujeta kot »molekularno merilo«. Ta model hkrati elegantno izključuje aktivacijo s fragmenti dsRNA, ki so krajši od potrebne dolžine, ki ustreza razdalji med obema mestoma, kot je siRNA. Minimalna razdalja med vezalnima mestoma na ektodomeni znaša približno 35 baznih parov dvojne vijačnice. Naš strukturni model sidranja dsRNA na dimer TLR3 ektodomen in modeliranje samega dimera sta identificirala aminokislinske ostanke, ki so odgovorni za vezavo in s tem za aktivacijo. To vezalno mesto ima strukturo, ki je podobna tipu in razporeditvi aminokislin na C-terminalnem segmentu, kar je pričakovano glede na simetrični dimerni ligand.
V predlaganem projektu bomo testirali omenjeno hipotezo s pripravo točkovnih mutant TLR3, kjer bomo inaktivirali vezalno mesto in določili učinek z merjenjem aktivacije s poli(I:C) in drugimi dsRNA zaporedji na celičnih linijah HEK293 transficiranimi s človeškim TLR3.
Izmerili bomo direktno vezavo dsRNA na ektodomeno TLR3. Pravilno lokalizacijo fuzijskih proteinov med TLR3 mutantami in GFP bomo preverjali s konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom. Podrobnejše informacije o mehanizmu delovanju TLR3 receptorja bi pomenile mejnik na tem področju, saj bi bila to prva molekularna karakterizacija prepoznavanja s TLR receptorji. Hkrati bi predstavljala dobro osnovo za model za prepoznavanje s TLR7,8 in 9, ki tudi prepoznavajo nukleinske kisline.
Naš projekt bo razložil selektivnost TLR3 do različnih dsRNA, ki se razlikujejo tako glede velikosti kot tudi glede na nukleotidna zaporedja. Poglobljeno znanje bo omogočilo boljše načrtovanje agonistov in antagonistov, ki bi lahko bili uporabni kot adjuvans za cepiva, zdravilo proti raku (preko podobnega mehanizma kot imikvimod) ali kot proti-vnetne učinkovine za zdravljenje artritisa, sistemskega lupus erithematosusa (SLE) ali ateroskleroze.
Pomen za razvoj znanosti
Projekt je pomembno doprinesel k razvoju znanosti o življenju z odkritji na področju mehanizma aktivacije enega od receptorjev TLR z virusno dvoverižno RNA (dsRNA). Te ugotovitve so pomembne za razumevanje obrambe imunskega sistema proti virusnim okužbam, ki so eden od glavnih razlogov za zdravstvene težave sodobnega časa. Biokemijske osnove interakcije med ektodomeno TLR3 in ligandom dsRNA bodo pomagale tudi pri raziskovanju mehanizma aktivacije drugih receptorjev TLR, ki zaznavajo nukleinske kisline. Spoznanja so medicinskega in biotehnološkega pomena, saj lahko doprinesejo k načrtovanju cepiv tako proti virusnim okužbam, kot tudi proti drugim boleznim, kjer delujejo ligandi TLR3 kot adjuvansi za ojačitev specifičnega imunskega odziva. Raziskava je po naravi interdisciplinarna. Združuje biokemijska dognanja o medmolekulskih interakcijah z znanjem o strukturi nukleinskih kislin, ki so tehtna z biotehnološkega in medicinskega vidika. Rezultati so pomembni predvsem za področje medicine z nedvomnim vplivom na izboljšanje zdravja človeka. Poglobljeno znanje, ki smo ga pridobili s študijo, bo omogočilo boljše načrtovanje agonistov in antagonistov, ki bi bili uporabni kot cepivo, zdravilo proti raku ali kot proti-vnetne učinkovine za zdravljenje artritisa, sistemskega lupusa erithematosusa (SLE), ateroskleroze, avtoimunskega encefalitisa in drugih. Projekt je bil pomemben tudi za izobraževanje dodiplomskih in podiplomskih študentov, ki so sodelovali pri posameznih segmentih študije. Tekom dela so pridobili pomembna znanja o laboratorijskem delu in znanstveni metodologiji ter so tako postali pomemben člen prihodnosti slovenske znanosti.
Pomen za razvoj Slovenije
V Sloveniji sodi naš laboratorij med pionirje na področju raziskav naravne imunosti, molekulske strukture in interakcij. Skrbimo za pomembno zalogo znanja za prihodnje generacije slovenskih znanstvenikov. Z izobraževanjem dodiplomskih in podiplomskih študentov doprinesemo pomemben delež h kakovosti in prepoznavnosti slovenske znanosti. Z udeležbami na tečajih in konferencah posredujemo naše znanje in izkušnje širši strokovni publiki. Znanje, ki smo ga pridobili tekom naše študije je ključno za boljše razumevanje molekularnega mehanizma aktivacije TLR3 z virusno dsRNA. Ta aktivacija je bistvena za takojšnji protivirusni imunski odziv, kot tudi za ojačitev specifičnega imunskega odziva. Proučili smo vlogo pozitivno nabitih aminokislinskih ostankov blizu N-terminalnega konca ektodomene TLR3 in ugotovili, da sestavljajo drugo vezavno mesto za dsRNA. Ugotovili smo tudi, da vezavni mesti interagirata samo s fosfatnim ogrodjem, ter da razdalja med njima ustreza natanko dolžini dveh zavojev dsRNA s konformacijo tipa A. To ustreza konformacijski hipotezi, ki pravi, da je edina oblika dsRNA, ki lahko aktivira TLR3, konformacijski tip A. Pokazali smo, da lahko TLR3 z razdaljo med obema vezavnima mestoma ločuje dsRNA od drugih nukleinskih kislin in tako deluje kot molekularno ravnilo za ločevanje lastnih nukleinskih kislin od tujih.
Rezultati naše raziskave so bili objavljeni v visoko priznani znanstveni reviji Nature Structural and Molecular Biology ter predstavljeni na številnih konferencah z mednarodno udeležbo. Na ta način smo predstavili visoko raven slovenske znanosti in doprinesli k njeni prepoznavnosti v svetu.
Rezultati raziskovalnega projekta so tudi ekonomsko pomembni, zanimivi za biotehnologijo in farmacevtsko industrijo ter lahko pomagajo pri izboljšanju zdravljenja številnih nalezljivih bolezni.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
2009,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
2009,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
