Projekti / Programi
MOLEKULARNA OPREDELITEV PODTIPSKIH RAZLIČIC HUMANIH VIRUSOV PAPILOMA HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31 IN HPV-53
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
Humani virusi papiloma, HPV, podtipske različice, genetska raznolikost, patogeneza, PCR
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
23430 |
dr. Boštjan Kocjan |
Mikrobiologija in imunologija |
Vodja |
2008 - 2010 |
231 |
Organizacije (1)
Povzetek
Humani virusi papiloma (HPV) so izjemno heterogena skupina majhnih virusov DNA, ki jih etiološko povezujemo z različnimi benignimi in malignimi spremembami kože in sluznic in so eden redkih primerov v humani virologiji, ko virusne genotipe lahko povežemo z določeno boleznijo. Ker se bolezen razvije le pri manjšini oseb, okuženih z določenim genotipom HPV, se domneva, da znotraj posameznega genotipa HPV obstajajo podtipske različice, ki so povezane oz. prispevajo k večji ali manjši patogenosti virusa.
Raziskave v okviru predlaganega raziskovalnega projekta bomo usmerili v reševanje vprašanj genetske raznolikosti, onkopatogeneze in evolucije podtipskih različic šestih genotipov HPV, in sicer HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31 in HPV-53. Genotipa HPV-6 in HPV-11 sta etiološko najpogosteje povezana z nastankom genitalnih bradavic in papilomov grla, medtem ko genotipe HPV-16, HPV-18 in HPV-31 najpogosteje povezujemo z nastankom malignih sprememb na materničnem vratu oz. rakom materničnega vratu (RMV). Pomen okužb z genotipom HPV-53 za nastanek RMV še ni pojasnjen. Vsi izolati HPV, ki jih bomo vključili v raziskavo, razen izolatov HPV-53, so bili predhodno osamljeni v Sloveniji - pri osebah z različnimi benignimi in malignimi spremembami epitela sluznic - in so del arhivske zbirke Inštituta za Mikrobiologijo in imunologijo, Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Izolate HPV-53, osamljene pri ženskah z normalno citologijo materničnega vratu, potencialno malignimi spremembami materničnega vratu in RMV, smo pridobili s pomočjo 8 partnerskih raziskovalnih skupin iz Evrope in ZDA. Podtipske različice izbranih genotipov (izolatov) HPV bomo opredelili z molekularno analizo treh do petih področij virusnega genoma. Pri tem bomo uporabili že opisane in preizkušene metode oz. protokole, kot tudi tiste, ki jih bomo razvili na novo.
Z rezultati raziskave bomo najverjetneje potrdili našo domnevo, da so analne bradavice povzročene z genotipom HPV-6, podobno kot genitalne bradavice in papilomi grla, posledica okužbe z ne-prototipskimi različicami HPV-6. Dobili bomo odgovor ali tudi pri HPV-6 filogenetsko najbolj sorodnem genotipu HPV, genotipu HPV-11, obstajajo podtipske različice oz. skupina različic, ki je značilno povezana z boleznimi, ki jih povzroča okužba s HPV-11. Pričakujemo, da bomo odkrili več novih podtipskih različic genotipa HPV-53, kot tudi to, da bomo dokončno potrdili oz. ovrgli domnevo, da so izjemno redki primeri RMV posledica okužbe z značilnimi - domnevno bolj patogenimi - podtipskimi različicami genotipa HPV-53. Pri treh, pri slovenskih ženskah z RMV najpogosteje osamljenih genotipih HPV, bomo - glede na rezultate predhodnih raziskav - najverjetneje opredelili več podtipskih različic ter na ta način pridobili osnovne informacije o tem ali so določene podtipske različice genotipov HPV-16, HPV-18 in HPV-31 v Sloveniji značilno povezane z nastankom dveh histološko najpogostejših oblik RMV - ploščatoceličnega in žleznega raka materničnega vratu. S pomočjo molekularno-filogenetskih analiz bomo skušali določiti približno starost slovenskih izolatov genotipov HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31 in HPV-53 ter pojasniti evolucijske procese in dogodke, ki vodijo oz. so vodili do nastanka podtipskih različic HPV. Menimo, da bodo rezultati predlaganega raziskovalnega projekta izreden doprinos k temeljnim znanjem s področja onkogeneze, patogeneze in evolucije podtipskih različic šestih - v Sloveniji klinično zelo pomembnih - genotipov HPV.
Pomen za razvoj znanosti
Z rezultati projekta smo pomembno prispevali k temeljnim znanjem s področja patogeneze in evolucije podtipskih različic petih v Sloveniji in v svetu klinično zelo pomembnih genotipov humanih virusov papiloma (HPV): HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18 in HPV-33. Na osnovi dobljenih rezultatov smo tako zaključili, da obstajajo podtipske različice genotipov HPV-6 in HPV-11 (t.i. neprototipske različice), ki so značilno povezane z boleznimi, ki jih povzročata okužbi s HPV-6 in HPV-11, to je z genitalnimi (GB) in analnimi bradavicami (AB) ter papilomi grla (PG). S pomočjo filogenetskih analiz smo ugotovili, da je večina podtipskih različic HPV-6 in HPV-11 nastala že pred selitvijo narodov iz Afrike, saj popolnoma enake ali zelo podobne podtipske različice teh genotipov najdemo na različnih predelih sveta. Nedavno razvito profilaktično štirivalentno cepivo proti okužbi s HPV-6, HPV-11, HPV-16 in HPV-18 pomeni izreden napredek medicine v boju proti okužbi in preprečevanju bolezni, ki so posledica okužbe s temi genotipi; cepivo vključuje virusom podobne delce virusnega plaščnega proteina L1 genotipov HPV-6, HPV-11, HPV-16 in HPV-18. V podoktorskem projektu smo s pomočjo molekularnih analiz gena L1 140 izolatov HPV-6 (N=77) in HPV-11 (N=63) osamljenih iz GB, AB in PG ugotovili, da obstajajo določene aminokislinske spremembe v proteinu L1 HPV-6 (dokazane pri 16,9% (13/77) analiziranih izolatov HPV-6 iz GB in PG) zaradi katerih bi se lahko zmanjšala učinkovitost tega cepiva proti okužbi s HPV-6 tako v Sloveniji kot tudi v svetu. V drugem delu raziskave, v katero smo vključili 71 naključno izbranih izolatov treh v Sloveniji najpogosteje zastopanih genotipov HPV (HPV-16, N=40; HPV-18, N=20; HPV-33, N=11) pri bolnicah z rakom materničnega vratu (RMV), smo dokazali številne podtipske različice teh genotipov. Poleg tega smo dokazali, da je bila večina HPV-16 in HPV-18 DNA pozitivnih RMV povzročena z evropskimi različicami teh genotipov, kar je v skladu s predhodno objavljenimi raziskavami o razporeditvi podtipskih različic HPV-16 in HPV-18 pri bolnicah z RMV v različnih evropskih državah. Poleg tega smo dokazali, da je bilo 25 (62,5%) od 40 vključenih HPV-16 pozitivnih RMV posledica okužbe z različico E6 T350G (L83V), ki je po podatkih iz literature povezana s povečanim tveganjem za nastanek RMV. Prav tako smo dokazali, da je bilo 6/11 (54,5%) s HPV-33 povzročenih primerov RMV posledica okužbe z ne-prototipskimi različicami tega genotipa, ki so po podatkih iz literature povezane s povečanim tveganjem za nastanek RMV. Z rezultati naše raziskava potrjujemo predhodne ugotovitve, da so se podtipske različice visokorizičnih genotipov HPV-16 oz. HPV-18 najverjetneje razvile šele po geografski razporeditvi prednika(ov) današnjega genotipa HPV-16 oz. HPV-18 in njegove kasnejše ko-evolucije z različnimi skupinami narodov in etničnih skupin. Ocenjujemo, da bodo v podoktorskem projektu pridobljena nukleotidna zaporedja genotipov HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18 in HPV-33 izrednega pomena za razvoj novih in izboljšavo obstoječih diagnostičnih testov za dokazovanje okužb s HPV. Tako smo na osnovi v tem projektu pridobljenih nukleotidnih zaporedij gena E1 HPV-6 in HPV-11 že razvili unikatno različico PCR-RFLP s katero je možno zanesljivo dokazati in opredeliti HPV-6 in HPV-11, prototipske in ne-prototipske različice HPV-6, kot tudi ostale z benignimi tumorji pogosto povezane HPV-genotipe: HPV-32, HPV-42, HPV-43, HPV-44 in HPV-55. Metoda je izrednega pomena, saj večina komercialno dostopnih genotipizacijskih testov ne omogoča simultane identifikacije vseh 7 genotipov, kot tudi ne prototipskih in neprototipskih različic HPV-6. Prav tako smo na osnovi novih pridobljenih nukleotidnih zaporedij gena E2 HPV-11 izboljšali našo originalno metodo RT-PCR za dokazovanje prototipskih in ne-prototipskih različic HPV-6, ki smo jo nadgradili tako, da omogoča tudi specifično zaznavanje HPV-11.
Pomen za razvoj Slovenije
Z rezultati naše raziskave smo prispevali ene prvih in hkrati zelo pomembnih informacij o številu, izvoru in povezavi podtipskih različic nekaterih - v Sloveniji klinično zelo pomembnih - genotipov HPV z boleznimi značilnimi za okužbo s temi virusi. Poleg tega smo s prvo podrobno opredelitvijo genotipov HPV v reprezentativni skupini slovenskih žensk z rakom materničnega vratu (RMV) ugotovili, da bi bilo mogoče v Sloveniji z uporabo štirivalentnega profilaktičnega cepiva proti okužbi s HPV-6, HPV-11, HPV-16 in HPV-18 preprečiti do 77,1% vseh primerov RMV, ki so posledica okužbe s HPV-16 in HPV-18. Podobno smo s pomočjo molekularnih analiz gena L1 140 izolatov HPV-6 in HPV-11 osamljenih iz genitalnih (GB) in analnih bradavic (AB) ter papilomov grla (PG) ugotovili, da bi bilo mogoče v Sloveniji z uporabo tega cepiva preprečiti tudi večino primerov GB, AB in PG, ki so posledica okužbe s HPV-6 in HPV-11. Značilne aminokislinske spremembe v proteinu L1 HPV-6, ki smo jih dokazali pri 16,9% (13/77) odstotkih analiziranih izolatov HPV-6 iz GB in PG, pa bi teoretično lahko zmanjšale učinkovitost tega cepiva proti okužbi s HPV-6. Rezultati raziskovalnega projekta so neposredno izrednega pomena za nadaljnji razvoj temeljnih molekularnih metod za opredeljevanje podtipske različnosti HPV kot tudi za izboljšanje diagnostike okužb s HPV, predvsem v smislu razvoja novih, zanesljivih, hitrih in klinično uporabnih molekularnih diagnostičnih metod.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2008,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
