Projekti / Programi
Novi lipidni modelni sistemi za določitev mehanizmov elektroporacije
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 2.06.07 |
Tehnika |
Sistemi in kibernetika |
Biomedicinska tehnika |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T115 |
Tehnološke vede |
Medicinska tehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 2.06 |
Tehniške in tehnološke vede |
Zdravstveni inženiring |
elektroporacija, nanoelektroporacija, liposomi, arheosomi, elektrokemoterapija, genska terapija, ablacijske metode, modeli elektroporacije, vnosni sistemi zdravilnih učinkovin
Raziskovalci (20)
Organizacije (3)
Povzetek
Cilj predlaganega projekta je razvoj novega sistem za vnos biološko aktivnih učinkovin, ki jih bomo vgradili v stabilne umetne liposome, zgrajene iz lipidov arhej, te vnesli v celico in dosegli nadzorovano sproščanje učinkovin iz liposomov z elektroporacijo le-teh z nanosekundnimi električnimi pulzi. V okviru predlaganega projekta bomo izpopolnili tudi dosedanje numerične modele elektroporacije na nivoju membrane, celice in tkiva. Skupaj z novim sistemom za vnos učinkovin bo to omogočilo bolj zanesljivo in učinkovito načrtovanje klinične elektrokemoterapije, ablacije tkiv z ireverzibilno elektroporacijo ter varne genske transfekcije v genski elektroterapiji in vakcinaciji z DNA.
Uporabnost liposomov v kliniki je že doslej vzpodbujala raziskave in razvoj novih, učinkovitejših lipidnih zgradb liposomov. Liposomi iz lipidov arhej (arheosomi) so tako kemično kot fizikalno bistveno bolj stabilni od navadnih liposomov in so kot taki obetavni kandidati za vnos snovi v celico, saj je pričakovati njihovo obstojnost tudi v notranjosti celice.
V zadnjih letih je razvoj tehnologije omogočil generiranje izredno kratkih in močnih električnih pulzov, s katerimi je mogoče doseči elektroporacijo membran organelov v celični notranjosti. Ta obetavna metoda (nanosekundna elektroporacija) omogoča elektroporacijo postendocitotskih veziklov, ki privede do sproščanja vsebine iz njihove notranjosti v citosol. To metodo nameravamo uporabiti za elektroporacijo internaliziranih liposomov, ki jih bomo pred vnosom v celico napolnili z učinkovinami.
Čeprav se področje uporabe elektroporacije (tudi nanosekundne) hitro širi, mehanizmi tega pojava in rezultirajočih učinkov, predvsem transmembranskega transporta, še niso natančno raziskani in pojasnjeni. Med cilji predlaganega projekta je tako tudi boljše razumevanje in poznavanje fizikalnih in bioloških procesov, na katerih temeljita elektroporacija in transport snovi skozi elektroporirano membrano. Za to je potrebno poznati električne lastnosti lipidnih dvoslojev, celic in tkiv, pa tudi povezave med zunajceličnim električnim poljem in transportom skozi membrano. Raziskave na tem področju so tako izrazito interdisciplinarne narave, saj zahtevajo tako izvajanje eksperimentov kot numerično modeliranje na različnih nivojih kompleksnosti, od planarnih lipidnih dvoslojev, preko umetnih veziklov in bioloških celic pa do tkiv (glej priponko slika.pdf).
Razvili bomo nove lipidne sisteme iz različnih kombinacij več vrst lipidov, od čistih arhealipidov do mešanic z običajnimi fosfolipidi, holesterolom in dodatkom proteinov, tako v planarnih dvoslojih kot v veziklih. Ti sistemi nam bodo omogočili popolno karakterizacijo sestave in biofizikalnih lastnosti zgrajenih membran. Z eksperimenti na teh sistemih in simulacijami molekularne dinamike lipidov v njih bomo poglobili razumevanje mehanizmov elektroporacije in transporta na molekularnem nivoju (nastanek por, njihovo zapiranje, gostota in porazdelitev velikosti por, transport skozi pore). Parametre pulzov, s katerimi bomo (tako pri klasični kot nanosekundni elektroporaciji) na planarnih dvoslojih dosegli optimalne rezultate, bomo ob upoštevanju novih dognanj o elektroporaciji in transportu, pridobljenih z modeliranjem na tem nivoju, nato preizkusili na celicah in vitro in končno na tkivih in vivo. Kvantitativne rezultate, pridobljene s simulacijami molekularne dinamike in poskusi na planarnih dvoslojih, bomo uporabili za izpopolnitev obstoječih numeričnih modelov celične in tkivne elektroporacije, ki temeljijo na metodi končnih elementov. Ti modeli bodo v primerjavi z dosedanjimi bistveno zanesljivejši za načrtovanje elektroporacije internaliziranih liposomov in nadzorovanega sproščanja njihove vsebine v citosol. Pridobljeno znanje in razumevanje bo omogočilo bolj zanesljivo in učinkovito načrtovanje klinične elektrokemoterapije, ablacije tkiv z ireverzibilno elektroporacijo ter varne genske transfekcije v genski elektroterapiji in vakcinaciji z DNA.
Pomen za razvoj znanosti
V okviru projekta smo naredili modele lipidnih membran arhej. Do sedaj ti lipidi še niso bili objavljeni v literaturi. Lipidi, ki sestavljajo lipidne membrane arhej, imajo posebno strukturo. Z molekularno dinamiko smo postoma preučili, kako posamezne strukture v lipidih molekulah vplivajo na stabilnost lipidnih dvoslojev. Ugotovili smo, da so membrane zelo stabilne, če jih izpostavimo električnemu polju. Deformacije v membrani pod vplivom električnega polja se razlikujejo od deformacij v drugih lipidnih membranah. To pojasnjuje zakaj v membrano ne prehajajo velike molekule. Te raziskave prispevajo k boljšemu razumevanju povezave med lipidno sestavo membran in njihovo stabilnostjo. Izboljšali smo pogoje gojenja A. pernix ter tako omogočili produkcijo zadostne biomase za potrebe raziskav naše skupine ter za sodelovanja z drugimi raziskovalnimi skupinami. Komercialno dostopni arheolipidi imajo na trgu zelo visoko ceno (500 mg stane 60.000 evrov – Avanti lipids), kar bi v bodoče prineslo tudi ekonomsko konkurenčnost na trgu. Razvili smo tvorjenje lipidnih dvoslojev iz arheolipidov, izdelavo različnih veziklov iz arheolipidov (MLV– multilamelarni, LUV– veliki unilamelarni, SUV– majhni unilamelarni; GUV – orjaški unilamelarni vezikli), ki smo jih napolnili z reporterskimi molekulami, ugotavljanje entalpijskih sprememb in kalorimetrijo, nanoporacijo celic z nanosekundnimi električnimi pulzi različnih parametrov. Zaradi poznavanja lastnosti različnih sistemov iz arheolipidov, ki jih lahko tvorimo, jih lahko v bodoče uporabimo tudi za aplikativne raziskave (npr. vnos molekul v celice, preko kože). Svoje znanje lahko v bodoče uporabimo tudi za razvoj novih tehnologij (razvoj novih sistemov za produkcijo biomase, nanosekundnih generatorjev pulzov z ustreznimi parametri itd.).
Pomen za razvoj Slovenije
Projekt je privedel do novih znanstvenih spoznanj na področju temeljnih raziskav mehanizmov elektroporacije, ki kljub intenzivnemu raziskovanju in uporabi v kliniki še niso popolnoma razjasnjeni. Poseben pomen našega projekta je bila povezava različnih raziskovalnih skupin v novo interdisciplinarno celoto, ki je s pomočjo različnih pristopov uspela zagotoviti razvoj področja preučevanja elektroporacije bioloških membran. K sodelovanju smo povabili Katedro za fizikalno kemijo Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani, kateri so naredili meritve elektronske gostote arhealnih lipidnih veziklov in mešanic z DPPC-jem. Simulacije molekularne dinamike smo naredili v sodelovanju z laboratorijem Équipe Théorie Simulations et Modélisation, Université de Lorraine (Francija), ki je eden od vodilnih v Evropi za simulacije na osnovi molekularne dinamike. MD je danes ena od najperspektivnejših metod v preučevanju dogodkov v bioloških sistemih na molekularni ravni. S tem bomo tudi Slovenijo vpeli v mednarodno dogajanje na tem področju raziskovanja.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2010,
2011,
2012,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2010,
2011,
2012,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
