Projekti / Programi
Molekularni mehanizem negativne regulacije TLR4 signalne poti preko kompleksa RP105/MD-1
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| P000 |
Naravoslovno-matematične vede |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.05 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Druge medicinske vede |
MD-1, RP105, MD-2, TLR4, LPS, naravna imunost, negativna regulacija
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
25436 |
dr. Jožica Vašl |
Naravoslovje |
Vodja |
2010 - 2013 |
37 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
21.007 |
Povzetek
Endotoksin (LPS; lipopolisharid) iz Gram-negativnih bakterij je eden izmed najmočnejših aktivatorjev naravnega imunskega sistema. Učinkovito prepoznavanje endotoksina zahteva koordinirano sodelovanje več zunajceličnih in membranskih LPS-vezavnih proteinov, kot so LBP, CD14, MD-2 in TLR4. TLR4 signalna pot je natančno regulirana, kajti poleg pretiranega imunskega odziva, ki lahko vodi v sepso ali avtoimunsko bolezen, pomanjkljiv odziv vodi v neučinkovito obrambo pred infektom. Vezava LPS na MD-2 sproži tvorbo aktivnega homodimera TLR4/MD-2, ki signal prenese v celico preko znotrajcelične TIR domene TLR4. Receptor RP105 je homolog družine TLR, ki za razliko od TLR4 nima znotrajcelične TIR domene. Vzporedno s TLR4, katerega signalizacija je odvisna od zunajceličnega proteina MD-2, je funkcionalnost RP105 odvisna od soizražanja proteina MD-1, ki je homolog MD-2. MD-1 za razliko od MD-2 ne veže LPS. Znano je, da se kompleks RP105/MD-1 veže na kompleks TLR4/MD-2 kar inhibira nastanek aktivnega homodimera TLR4/MD-2 in onemogoča prenos signala v celico, vendar so doslej predvidevali, da inhibicijo določajo interakcije med MD-2 in MD-1. RP105 regulira TLR4 signalizacijo v dendritičnih celicah ter in vivo, kar mu daje oznako fiziološkega inhibitorja TLR4 odziva.
Molekularni model aktivnega homodimera TLR4/MD-2/LPS, predlagan s strani naše raziskovalne skupine, ki je bil kasneje potrjen z določeno kristalno strukturo, predstavlja dobro osnovo za študij molekularnega mehanizma negativne regulacije TLR4 signalne poti preko kompleksa RP105/MD-1. LPS se kot monomer preko lipida A veže v hidrofobni žep proteina MD-2, kar povzroči dimerizacijo membranskega receptorja TLR4 preko dveh vezavnih mest na zunajcelični domeni TLR4. Glede na homologijo med paroma RP105/MD-1 in TLR4/MD-2 ter znanimi biokemijskimi podatki predlagamo hipotezo, da omenjena para tvorita heterotetramer RP105/MD-1:TLR4/MD-2 v katerem ne more priti do dimerizacije TIR domen. Na podlagi predvidevanj, da je kontakt med MD1-TLR4 in MD-2-RP105 podoben geometriji proteinskih enot aktivnega tetramera (TLR4/MD-2)2, predlagamo molekularen model heterotetramera RP105/MD-1:TLR4/MD-2. Doslej so predvidevali, da inhibicijo določa direktna interakcija med MD-2 in MD-2. Pripravili smo hibrid med MD-2 in MD-1, ki veže TLR4 a hkrati ne veže LPS. Preliminarni rezultati inhibicije TLR4 signalizacije s hibridom so v skladu predlaganim modelom inhibicije in potrjujejo hipotezo, da hibrid na TLR4 deluje kot antagonist. Hibrid MD-2/MD-1 posledično predstavlja dobro osnovo za razvoj novega tipa inhibitorjev endotoksina.
Mesta mutageneze na RP105 in MD-1 bomo izbirali glede na predpostavljen molekularen model heterotetramernega kompleksa. Hibrid MD-2/MD-1 bomo izrazili v bakterijah in sesalskih celičnih linijah. Aktivacijo oz. inhibicijo TLR4 signalne poti bomo spremljali na nivoju fosforilacije, transkripcije (RT-PCR) in translacije (luciferazni reporterski sistemi, ELISA vnetnih citokinov). Spremljali bomo tudi celično lokalizacijo ter zunajcelično akumulacijo preiskovanih proteinov in njihovih mutant. Lastnosti proteina bomo določili s spektroskopskimi in drugimi biokemijskimi metodami. V raziskovalni skupini obvladujemo širok nabor eksperimentalnih metod proteinske in celične biologije in smo na področju TLR receptorjev in nevtralizatorjev LPS dobro uveljavljeni v svetu. Raziskave na miših modelih bomo opraviti v laboratoriju prof. Karp iz Cincinnatija.
Pomen za razvoj znanosti
Bakterijske infekcije so kljub dostopnosti antibiotikov še vedno eden glavnih vzrokov za nastanek bolezni. Bakterije imajo določeno sposobnost mutiranja. Antibiotiki uničijo tiste bakterije, ki so občutljive na njihovo delovanje, kar pa mutiranim sevom omogoča, da se še bolj razmnožujejo. Gre namreč za preživetje močnejšega. Uporaba antibiotikov dejansko spodbuja razvoj mutiranih super-bakterij, ki so odporne na zdravila. Zgleda, da zdravniki v bolnišnicah in klinikah povsod po svetu izgubljajo bitko proti pojavu vedno novih odpornih bakterijskih infekcij. To je tudi razlog, da je natančno poznavanje molekularnih mehanizmov bakterijskega odziva nujno potrebno. Cilj našega projekta je bila podrobna določitev molekularnega mehanizma RP105/MD-1, ki deluje kot fiziološki inhibitor signalizacijske poti TLR4. Strukturna, biokemijska in funkcijska analiza inhibitornega kompleksa TLR4/MD-2:RP105/MD-1 je poglobila dosedanje znanje in razumevanje imunologije TLR4. Poleg tega so rezultati zagotovili razvoj metode, kjer bodo RP105/MD-1 in njegovi analogi uporabljeni kot specifični inhibitorji TLR4. Naš interdisciplinarni pristop, ki združuje strokovno znanje strukturne in celične biologije, predstavlja inovativen in izviren doprinos na zelo kompetitivnem področju naravne imunosti. Dolgoročno bodo lahko naši rezultati uporabni pri zdravljenju pretiranih oziroma neprimernih vnetnih procesov, kamor spadajo avtoimunske bolezni, patološki sistemski odzivi na različne poškodbe ter lokalizirane in sistemske infekcije, kot sta npr. sepsa in meningitis. Naša raziskovalna skupina ima obsežno strokovno znanje s področja načrtovanja inhibitorjev TLR receptorjev, saj smo že identificirali in tudi patentirali spojine, ki imajo potencial za zdravljenje vnetnih bolezni. Gre za inhibitorje TLR4/MD-2 aktivacije. Poznavanje in razumevanje vloge receptorskega kompleksa RP105/MD-1 v inhibiciji TLR4 signalizacije bi lahko razširilo uporabnost teh spojin in povečalo uspešnost zdravljenja omenjenih bolezni.
Pomen za razvoj Slovenije
Uporaba in bogatenje lastnega znanja je najboljši način trajnostnega razvoja, saj zagotavlja visoko dodano vrednost ob hkratnem ohranjanju okolja. Projekt je bil odprt tudi za sodelovanje z drugimi znanstvenimi institucijami v Sloveniji in s širšim evropskim in svetovnim okoljem. Raziskave na medicinsko pomembnih problemih vodijo k izboljšanju zdravja oz. k zmanjšanju ekonomske in družbeno-socialne škode zaradi bolezni. Predlagana raziskava vsebuje številna orodja sodobne strukturne in celične biologije. Raziskava temelji na odkrivanju osnovnih spoznanj s področja medicine s takojšnjo možnostjo aplikativnih raziskav v farmacevtski industriji. Pridobljena znanja bomo objavili v znanstveni reviji s faktorjem vpliva, saj je članek že v pošiljanju. Nova spoznanja smo predstavili na mednarodnih konferencah v obliki predavanj, kar je pomenilo promocijo za Slovenijo v svetu. Poleg strokovnih srečanj pa smo naše pridobljeno znanje predajali dijakom, diplomantom in doktorandom.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
