Projekti / Programi
Implementacija ionske kromatografije-tandemske masne spektrometrije v analitiki kratkoverižnih RNK molekul: razvoj metodologije in analiznih protokolov
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.03.07 |
Biotehnika |
Rastlinska produkcija in predelava |
Tehnologija živil rastlinskega izvora |
| Koda |
Veda |
Področje |
| T490 |
Tehnološke vede |
Biotehnologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.04 |
Kmetijske vede in veterina |
Kmetijska biotehnologija |
ESI ionizacija, glivna kultura, ionska kromatografija, kratkoverižna RNK, masna spektrometrija, miRNK, rastlinska kultura, separacijske tehnike, siRNK, terciarna struktura, transkriptomika
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
24445 |
dr. Mitja Križman |
Kemija |
Vodja |
2010 - 2012 |
150 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0104 |
Kemijski inštitut |
Ljubljana |
5051592000 |
21.007 |
Povzetek
Projekt je vsebinsko osredotočen na področje transkriptomike. V okviru prijavljenega projekta bomo razvili nove analizne postopke, osnovane na sklopitvi ionske kromatografije in tandemske masne spektrometrije, za določanje vsebnosti in strukture (nukleotidnega zaporedja) kratkoverižnih RNK molekul v bioloških vzorcih.
Razvili bomo separacijski sistem (kombinacija eluenta, kromatografske kolone ter ostalih pogojev), ki bo omogočal učinkovito separacijo RNK molekul do velikosti 30 nukleotidov, na osnovi mehanizma ionske izmenjave. Pričakujemo, da v primerjavi z običajno uporabljeno separacijo na reverzno-fazni koloni bomo dosegli bolj enakomerno velikostno porazdelitev analitov med separacijo zaradi drugačnega mehanizma separacije (porazdelitev ionskega naboja). Poleg tega predvidevamo, da bomo najboljše rezultate (selektivnost separacije) dosegli na osnovi separacije molekul RNK na ionskem izmenjevalcu z visoko gostoto fukcionalnih skupin ter ob primerni izbiri pH mobilne faze, ionske jakosti le-te ter temperature separacije dosegli vsaj do določene mere tudi diskriminacijo med analiti na osnovi njihovega nukleotidnega zaporedja (zaradi razlik v sekundarni oziroma terciarni strukturi). Za dosego primerne občutljivosti (poleg selektivnosti) predvidevamo, da bo morala separacija temeljiti na gradientni eluciji (predkoncentriranje na koloni). Vkolikor bo to potrebno, bomo uporabili tudi primeren post-kolonski razsoljevalnik mobilne faze (supresor), da bomo tako dosegli sestavo mobilne faze, ki bo kompatibilna z masno spektrometrično (MS) detekcijo.
Masna-spektrometrična detekcija bo osnovana na ionizaciji analitov v elektro-razprševalnem (ESI, angl. Electrospray) ionskem izvoru. Tu bo ključnega pomena izbira ionizacijskih pogojev, z namenom preprečiti prekomerno ionizacijo molekul RNK, ter s tem čimbolje izkoristiti instrumentalne zmogljivosti kvadrupolnega masnega spektrometra. Ob primerni ESI ionizaciji, bo z MS detekcijo možno selektivno določevanje molekul RNK, tudi v bolj kompleksnih vzorcih, t.j. v izolatih celic oziroma kultur, z zadostno stopnjo občutljivosti detekcije. Obenem pa bo s fragmentacijo (tandemska MS) možna tudi karakterizacija molekul RNK v smislu njihove nukleotidne sestave.
Različne izolate rastlinske kulture hmelja (Humulus lupulus) in kulture fitopatogene glive (Verticillium albo-atrum) bomo uporabili za analizo sestave kratkoverižnih molekul RNK. Pri analizi omenjenih bioloških vzorcev bomo primerjali tudi njihovo sestavo v odvisnosti od induciranih stresnih pogojev, katerim bodo kulture načrtno izpostavljene (npr. slanost, temperatura itd.). S tem pričakujemo, da bomo lahko pridobili informacijo o molekulah RNK kot potencialnih pokazateljev stresa za omenjene organizme. S poznavanjem pojavnosti določenih karakterističnih molekul RNK bo omogočen boljši vpogled v fiziološko stanje rastlinske (ali glivne) kulture ter s tem posledično razvoj učinkovitejšega pristopa in vitro kultiviranja le-teh kot tudi poznavanja celičnih mehanizmov.
Ker je učinkovitost analizne metode v veliki meri odvisna tudi od načina priprave vzorca, bomo del svojih aktivnosti posvetili tudi tej problematiki. Sprva bomo uporabili že uveljavljene protokole za izolacijo kratkoverižne RNK ter preverili njihovo primernost pri delu z IC-MS tehniko. Ob ugotovljeni nekompatibilnosti obstoječih protokolov za MS detekcijo (interference, artefakti), bo le-te potrebno prilagoditi oziroma na novo razviti specifične protokole za izolacijo kratkoverižne RNK, kot spremljajoč, a nujen del naše raziskovalne dejavnosti.
Področje transkriptomike doživlja v zadnjem desetletju izreden porast znanstvenih odkritij in posledično znanstvenih publikacij, zaradi svojega izrednega pomena na področju bioznanosti. Ker pa razvoj primernih analiznih orodij na tem področju zaostaja za samimi znanstvenimi odkritji menimo, da bo uporaba IC-MS tehnike predstavljala učinkovitejše orodje za kvalitativno in kvantitativno določevanje kratkoverižnih molekul RNK.
Pomen za razvoj znanosti
Pridobljena znanja in postopki v sklopu projekta so uporabni na področju različnih znanstvenih disciplin za analize kratkoverižnih RNK molekul (biokemija, farmacija, agronomija, veterina in medicina). V primerjavi z uveljavljenimi molekulsko genetskimi tehnikami predstavljajo hitrejše in cenovno ugodnejše analizno orodje. Tu velja izpostaviti, da razvoj postopkov v sklopu projekta ni bil primarno namenjen direktni zamenjavi uveljavljenih analiznih protokolov, temveč komplementarnih orodij, ki bi predstavljala alternativo in dopolnitev obstoječih postopkov, zlasti ko gre za presejalne teste in iskanje potencialnih markerjev, kjer je zaželjena enostavna priprava vzorcev, brez motečih vplivov matriksa vzorca. Uporabnost postopkov separacije, detekcije in priprave vzorcev RNK je zato široka: od raziskav v kmetijstvu do kliničnih raziskav. Obenem pa možnost uporabe LC-MS instrumentov, namesto težje dostopnih IC-MS instrumentov, odpira večje število priložnosti za vpeljavo teh postopkov v druge laboratorije. Pri kliničnih raziskavah je še dodatno zanimiv postopek za analizo nukleotidne sestave DNK (s plinsko kromatografijo), s čimer je možno ugotavljati stopnjo oksidacije le-te oz. stopnjo oksidacijskega stresa organizma. Velja poudariti tudi, da so posamezni deli postopkov (separacija, detekcija, priprava vzorcev) prav tako potencialno uporabni oz. prenosljivi na druge, sorodne aplikacije.
Pomen za razvoj Slovenije
Farmacevtska industrija bo v prihodnosti komercializirala tudi pripravke na osnovi kratkoverižnih RNK molekul (sodeč po številu patentov), zato bo uporabnost razvitih postopkov zelo aktualna pri razvojnem delu in kontroli kakovosti omenjenih pripravkov. Posledično je pričakovati, da bo že sicer dobro sodelovanje med farmacevtsko industrijo in Kemijskim inštitutom, bilo še intenzivnejše. Metodologija pa ima svoje potencialno mesto tudi v klinični diagnostiki, s čimer bi lahko znatno pocenili oziroma uvedli nove presejalne teste za nekatere bolezni, in v kmetijstvu ter veterinarski stroki. Na področju klinične diagnostike (zasebne ali v okviru zdravstvenih zavodov) obstaja tudi možnost izvajanja analiz z namenom ugotavljanja oksidacijskega stresa. Nenazadnje pa idejna zasnova novega tipa razsoljevalca mobilne faze ponuja dobre možnosti z vidika podjetniške iniciative za izdelavo in prodajo tovrstnih naprav z visoko dodano vrednostjo.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2010,
2011,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2010,
2011,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
