Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Mobilnost sekrecijskih mešičkov in homeostaza kalcija v astrocitih

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
3.03.00  Medicina  Nevrobiologija   

Koda Veda Področje
B470  Biomedicinske vede  Fiziologija 

Koda Veda Področje
3.01  Medicinske in zdravstvene vede  Temeljna medicina 
Ključne besede
astrociti, homeostaza kalcija, mobilnost mešičkov, eksocitoza, konfokalna mikroskopija, mikroskopija popolnega notranjega odboja fluorescence (TIRF)
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (22)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  33901  dr. Patrizia D'Adamo  Medicina  Raziskovalec  2011 - 2014  33 
2.  00449  dr. Iztok Dolenc  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2011 - 2014  110 
3.  23345  dr. Mateja Gabrijel  Farmacija  Raziskovalec  2012  47 
4.  18548  dr. Helena Haque Chowdhury  Nevrobiologija  Raziskovalec  2014  155 
5.  27585  dr. Jernej Jorgačevski  Medicina  Raziskovalec  2011 - 2014  180 
6.  33030  dr. Doron Kabaso  Fizika  Raziskovalec  2012  26 
7.  30696  dr. Miša Korva  Mikrobiologija in imunologija  Raziskovalec  2012  188 
8.  30697  dr. Anja Kovanda  Nevrobiologija  Raziskovalec  2012 - 2014  77 
9.  15666  dr. Marko Kreft  Nevrobiologija  Vodja  2011 - 2014  685 
10.  28325  dr. Mateja Lobe Prebil  Medicina  Raziskovalec  2013  25 
11.  23346  dr. Tina Pangršič Vilfan  Nevrobiologija  Raziskovalec  2011 - 2014  49 
12.  21390  dr. Maja Potokar  Medicina  Raziskovalec  2011 - 2014  161 
13.  22459  dr. Tadeja Režen  Nevrobiologija  Raziskovalec  2011 - 2012  246 
14.  32000  dr. Boštjan Rituper  Mikrobiologija in imunologija  Raziskovalec  2014  68 
15.  15813  dr. Boris Rogelj  Nevrobiologija  Raziskovalec  2011 - 2014  412 
16.  15467  dr. Matjaž Stenovec  Medicina  Raziskovalec  2011 - 2014  202 
17.  14829  dr. Veronika Stoka  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2011 - 2014  237 
18.  26198  dr. Urban Švajger  Mikrobiologija in imunologija  Raziskovalec  2011 - 2012  208 
19.  35836  dr. Slavica Terzieva  Medicina  Raziskovalec  2013 
20.  31572  dr. Saša Trkov Bobnar  Mikrobiologija in imunologija  Raziskovalec  2011 - 2014  56 
21.  20214  dr. Nina Vardjan  Nevrobiologija  Raziskovalec  2012 - 2014  269 
22.  32525  dr. Jelena Velebit Marković  Nevrobiologija  Raziskovalec  2013  40 
Organizacije (2)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0106  Institut "Jožef Stefan"  Ljubljana  5051606000  91.855 
2.  0381  Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta  Ljubljana  1627066  48.704 
Povzetek
Veda o možganih je vstopila v novo obdobje, v katerem razumemo celice glije kot aktivne udeležence pri uravnavanju delovanja možganskih omrežij in vedenju, tako v zdravju kot bolezni. Astrociti, najštevilčnješi tip celic glije v možganih človeka, so mnogonamenske celice, ki modulirajo sinaptično plastičnost, učenje, spomin in spanje. Astrociti lahko signalizirajo sosednjim celicam na različne načine - preko ionskih kanalčkov, prenašalcev, membranskih receptorjev, toda ključni mehanizem kemičnega signaliziranja je verjetno uravnavana eksocitoza, čeprav je ta še vedno predmet razprav. Navkljub razumevanju nekaterih bistvenih dejavnikov, ki so vključeni v eksocitozno zlivanje mešičkov, je presentljivo malo znanega o pato-/fiziološkem uravnavanju prometa mešičkov ter izločanju prenašalcev glije. Uravnavanje prometa mešičkov s pato-/fiziološkimi dejavniki lahko proučujemo le s tehnikami, ki omogočajo meritve časovno-prostorskih vzorcev citosolne aktivnosti kalcija, sledenje premikov posameznih mešičkov in eksocitozno izločanje njihove vsebine. Z uporabo dveh različnih optofizioloških tehnik bomo raziskali spremembe i) homeostaze kalcija, ii) mobilnosti mešičkov in iii) eksocitozno izločenje vkladiščenih snovi, izzvane s fiziološkima regulatorjema aktivnosti astrocitov (L-glutamat, ATP), ki vplivata na metabotropne in ionotropne glutamatne receptorje ter na purinergične receptorje, in deloma uravnavata sproščanje kalcija iz znotrajceličnih zalog. Astrocite bomo izpostavili permeabilnemu fluorescentnemu indikatorju kalcija, Fluo-4-AM (Kd ~345 nM), in v realnem času izmerili povečanje kalcijeve aktivnosti kot porast fluorescence Fluo-4. Kvantificirali bomo največjo spremembo fluorescence, razpolovni čas, frekvenco nihanja kalcijeve aktivnosti in ocenili celokupni čas povečane kalcijeve aktivnosti v posamezni celici. Vpliv dražljajev na mobilnost bomo ugotavljali v peptidergičnih mešičkih, ki jih bomo napolnili s sekrecijskim peptidom označenim z mutirano zeleno fluorescentno beljakovino (ANP.emd), in v kislih mešičkih - endosomih in lizosomih, ki jih bomo obarvani z barvilom Lysotracker. Izmerili bomo spremembo povprečne hitrosti mešičkov, prepotovano pot, največji odmik in določili usmerjenost gibanja mešičkov. Učinkovitost izzvane eksocitoze na ravni cele celice bomo določili s pomočjo relativnega zmanjšanja števila fluorescentih mešičkov, na ravni posameznih mešičkov izmerili hitrost zmanjšanja fluorescence ANP.emd in barvila Lysotracker, ki kaže na izločenje vsebine mešičkov. Nato bomo raziskali povezavo med mobilnostjo mešičkov in verjetnostjo za zlivanje ter izločenje njihove vsebine. Poizkušali bomo identificirati, kateri mešički – bodisi mobilni bodisi mirujoči - so verjetnejši kandidati za zlivanje in izločenje vsebine po draženju celic. V nadaljevanju bomo raziskali vpliv lipidnih spojin, ki uravnavajo učinkovitost sestavljanja kompleksov SNARE in posledično proces eksocitoze v živčnih ter nevroendokrinih celicah, toda nikoli niso bile testirane v astrocitih. Za ta namen bomo vzpostavili sodelovanje z Dr. Bazbekom Davletovom (Cambridge, VB) in identificirali lipide – potencialno sfingozin, ki aktivira Sinaptobrevin-2 v živčnih in nevroendokrinih celicah, ter fingolimod (FTY720), farmakološko relevanti strukturni analog sfingozina – z morebitnim vplivom na aktivacijo Sinaptobrevina-2 in nastanek kompleksov SNARE, ki so vključeni v zlivanje astrocitnih membran. Vpliv izbranih lipidov na promet mešičkov in/ali eksocitozo astrocitov bomo izmerili v realnem času s konfokalno mikroskopijo in mikroskopijo popolnega notranjega odboja fluorescence (TIRF), s katero bomo ugotavljali morebitne razlike v vplivu lipidov v dveh, temeljno različnih predelih celice – v tankem sloju citoplazme ob bazalni plazmalemi in v notranjosti celice. Z namenom, da bi opredelili morebitni značilni čas medmolekulskih interakcij v zaključni stopnji uravnavane eksocitoze, bomo izmerili latenco med vsidranjem mobilnih mešičkov in izločenjem njihove vsebine.
Pomen za razvoj znanosti
Sfingozin, naravni znotrajcelični metabolit, in njegov mimetik fingolimod (FTY720) zavirata mobilnost astrocitnih mešičkov in sekrecijo prenašalcev glije s povečanjem [Ca2+]i. Astrociti, najštevilčnejši tip celic glije v možganih sesalcev zagotavljajo metabolno podporo nevronom, souravnavajo sinaptično aktivnost in mikropretok krvi v možganovini. Poškodbe nevronov zaradi okužb, mehanske travme, avtoimunskih odzivov in nevrodegenerativnih bolezni praviloma aktivirajo astrocite, ki vstopijo v proces astroglijoze. Proliferirajoči astrociti lahko omejujejo širjenje vnetnih celic, popravijo poškodovano krvno-možgansko bariero, zamejijo poškodbe tkiva in njihovo velikost ter zmanjšajo izgube nevronov in obseg demielinizacije. Motnje v astrocitnih funkcijah praviloma vodijo v disfunkcijo nevronov in nastanek različnih bolezenskih stanj vključno z multiplo sklerozo. Ključni proces kemične signalizacije med astrociti in sosednjimi možganskimi celicami je uravnavana eksocitoza, med katero se zlijeta membrana sekrecijskega mešička in plazmalema; vsebina vskladiščena v lumnu mešička se difuzijsko izloči v zunajcelični prostor. Astrociti izločajo različne kemične prenašalce kot so L-glutamat, D-serin, ATP, sekrecijski peptidi, tumorski nekrotični dejavnik ?, interlevkini in prostaglandini, ki lahko igrajo ključno vlogo tudi v napredovanju bolezenskih stanj živčnega sistema. Pokazali smo, da sfingozin in FTY720 (v nefosforilirani obliki), zavreta uravanavano eksocitozo prenašalcev glije tako, da zavreta mobilnost astrocitnih mešičkov (peptidergičnih, glutamatergičnih in endosomov/lizososmov) in preprečujeta njihovo učinkovito interakcijo z mesti sidranja/zlivanja na plazmalemi. V raziskavi smo nadalje raziskali znotrajcelične signalne poti, ki so udelžene v zaviranju sekrecije prenašalcev glije. Razkrili smo vzročno povezavo med spremenjeno homeostazo citosolnega kalcija in mobilnostjo astrocitnih mešičkov zaradi delovanja nefosforiliranih, biološko aktivnih sfingolipidov. Z lipidi izzvano povečanje [Ca2+]i je sovpadalo z zmanjšano mobilnostjo peptidergičnih mešičkov, kar smo neodvisno potrdili v astrocitih, v katerih smo izzvali prehodno povečanje [Ca2+]i z draženjem glutamatnih in purinskih receptorjev v plazmalemi. FTY720 in sfingozin sta izzvala dolgotrajno povečanje [Ca2+]i v prisotnosti in odsotnosti zunajceličnih Ca2+. Z uporabo farmakoloških blokatorjev smo razkrili, da sta aktivacija fosfolipaze C in IP3 receptorjev potrebna in zadostna za povečanje [Ca2+]i, ki jo izzovejo lipidi. Eksogeni, sfingozinu podobni lipidi tako izzovejo kompleksne, od Ca2+-odvisne učinke, ki vplivajo na strukturo citoskeleta in zmanjšajo mobilnost mešičkov, ki je sklopljena z mikrotubulskim citoskeletom. Selektivno zaviranje eksocitoze v astrocitih lahko vodi v zmanjšanje z astrociti posredovanih toksičnih učinov na nevrone in posledično upočasnitev poteka bolezni. Eno od ključnih vprašanj, ki ostaja neodgovorjeno, je ali lahko FTY720 izzove podobne učinke tudi v bolnikih, ki dolgotrajno uživajo FTY720. Pričakovana terapevtska doza FTY720 v krvni plazmi je v rangu nanomolov, čeprav postaja jasno, da lahko FTY720 v možganovini doseže mikromolarno koncentracijo, še posebej na žilno-astrocitni meji, zaradi lipofilne narave zdravilne učinkovine. Lokalna koncentracija FTY720 je tako lahko zelo povečana in doseže koncentracijo, ki izzove zmanjšanje mobilnosti astrocitnih mešičkov in zavre njihovo sekrecijsko aktivnost. Izboljšanje simptomatike multiple skleroze po dolgotrajnem uživanju FTY720 je tako lahko delno posledica spremenjene fiziologije astrocitov.
Pomen za razvoj Slovenije
Nova metoda (platforma) za iskanje biološko aktivnih molekul, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov na podlagi analize mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z bolezenskimi stanji Metoda za proučevanje bioloških učinkov sestavin serumov in cerebrospinalne tekočine na posameznih evkariontskih celicah s specifično obarvanimi znotrajceličnimi organeli. Evkariontsko celico v kulturi lahko izpostavimo hidrofilnim ligandom, ki delujejo po vezavi na receptorje v plazmalemi in aktivirajo znotrajcelične signalne poti, ali lipofilnim molekulam, ki prehajajo preko plazmaleme in posredno ali neposredno vplivajo na mobilnost znotrajceličnih organelov zaradi delovanja na citoskelet in/ali na verjetnost spontanega ali izzvanega zlivanja vsidranih mešičkov ter sprostitev njihove vsebine v zunajcelični prostor. V okviru projekta smo pripravili vlogo za patentno varstvo. Po prijavi nacionalnega patenta na Uradu RS za intelektualno lastnino, dne 11.7.2011, smo v letu 2012 vlogo razširili z mednarodno patentno prijavo. Zahtevo za podelitev mednarodnega patenta smo vložili 24.04.2012 na Svetovno organizacijo za intelektualno lastnino (World Intellectual Property Organization - WIPO) v Ženevi pod številko PCT/EP2012/001759. Patent je bil skupaj s poročilom o poizvedbi objavljen 17.01.2013 pod številko objave: WO/2013/007325. V letu 2013 je bila veljavnost patenta na Svetovni organizaciji za intelektualno lastnino podaljšana. V mesecu februarju 2014 je bila vložena tudi vloga za podelitev patenta v Združenih državah Amerike.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, 2013, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, 2013, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Zgodovina ogledov
Priljubljeno