Projekti / Programi
Mobilnost sekrecijskih mešičkov in homeostaza kalcija v astrocitih
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.03.00 |
Medicina |
Nevrobiologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B470 |
Biomedicinske vede |
Fiziologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
astrociti, homeostaza kalcija, mobilnost mešičkov, eksocitoza, konfokalna mikroskopija, mikroskopija popolnega notranjega odboja fluorescence (TIRF)
Raziskovalci (22)
Organizacije (2)
Povzetek
Veda o možganih je vstopila v novo obdobje, v katerem razumemo celice glije kot aktivne udeležence pri uravnavanju delovanja možganskih omrežij in vedenju, tako v zdravju kot bolezni. Astrociti, najštevilčnješi tip celic glije v možganih človeka, so mnogonamenske celice, ki modulirajo sinaptično plastičnost, učenje, spomin in spanje. Astrociti lahko signalizirajo sosednjim celicam na različne načine - preko ionskih kanalčkov, prenašalcev, membranskih receptorjev, toda ključni mehanizem kemičnega signaliziranja je verjetno uravnavana eksocitoza, čeprav je ta še vedno predmet razprav. Navkljub razumevanju nekaterih bistvenih dejavnikov, ki so vključeni v eksocitozno zlivanje mešičkov, je presentljivo malo znanega o pato-/fiziološkem uravnavanju prometa mešičkov ter izločanju prenašalcev glije. Uravnavanje prometa mešičkov s pato-/fiziološkimi dejavniki lahko proučujemo le s tehnikami, ki omogočajo meritve časovno-prostorskih vzorcev citosolne aktivnosti kalcija, sledenje premikov posameznih mešičkov in eksocitozno izločanje njihove vsebine. Z uporabo dveh različnih optofizioloških tehnik bomo raziskali spremembe i) homeostaze kalcija, ii) mobilnosti mešičkov in iii) eksocitozno izločenje vkladiščenih snovi, izzvane s fiziološkima regulatorjema aktivnosti astrocitov (L-glutamat, ATP), ki vplivata na metabotropne in ionotropne glutamatne receptorje ter na purinergične receptorje, in deloma uravnavata sproščanje kalcija iz znotrajceličnih zalog. Astrocite bomo izpostavili permeabilnemu fluorescentnemu indikatorju kalcija, Fluo-4-AM (Kd ~345 nM), in v realnem času izmerili povečanje kalcijeve aktivnosti kot porast fluorescence Fluo-4. Kvantificirali bomo največjo spremembo fluorescence, razpolovni čas, frekvenco nihanja kalcijeve aktivnosti in ocenili celokupni čas povečane kalcijeve aktivnosti v posamezni celici. Vpliv dražljajev na mobilnost bomo ugotavljali v peptidergičnih mešičkih, ki jih bomo napolnili s sekrecijskim peptidom označenim z mutirano zeleno fluorescentno beljakovino (ANP.emd), in v kislih mešičkih - endosomih in lizosomih, ki jih bomo obarvani z barvilom Lysotracker. Izmerili bomo spremembo povprečne hitrosti mešičkov, prepotovano pot, največji odmik in določili usmerjenost gibanja mešičkov. Učinkovitost izzvane eksocitoze na ravni cele celice bomo določili s pomočjo relativnega zmanjšanja števila fluorescentih mešičkov, na ravni posameznih mešičkov izmerili hitrost zmanjšanja fluorescence ANP.emd in barvila Lysotracker, ki kaže na izločenje vsebine mešičkov. Nato bomo raziskali povezavo med mobilnostjo mešičkov in verjetnostjo za zlivanje ter izločenje njihove vsebine. Poizkušali bomo identificirati, kateri mešički – bodisi mobilni bodisi mirujoči - so verjetnejši kandidati za zlivanje in izločenje vsebine po draženju celic. V nadaljevanju bomo raziskali vpliv lipidnih spojin, ki uravnavajo učinkovitost sestavljanja kompleksov SNARE in posledično proces eksocitoze v živčnih ter nevroendokrinih celicah, toda nikoli niso bile testirane v astrocitih. Za ta namen bomo vzpostavili sodelovanje z Dr. Bazbekom Davletovom (Cambridge, VB) in identificirali lipide – potencialno sfingozin, ki aktivira Sinaptobrevin-2 v živčnih in nevroendokrinih celicah, ter fingolimod (FTY720), farmakološko relevanti strukturni analog sfingozina – z morebitnim vplivom na aktivacijo Sinaptobrevina-2 in nastanek kompleksov SNARE, ki so vključeni v zlivanje astrocitnih membran. Vpliv izbranih lipidov na promet mešičkov in/ali eksocitozo astrocitov bomo izmerili v realnem času s konfokalno mikroskopijo in mikroskopijo popolnega notranjega odboja fluorescence (TIRF), s katero bomo ugotavljali morebitne razlike v vplivu lipidov v dveh, temeljno različnih predelih celice – v tankem sloju citoplazme ob bazalni plazmalemi in v notranjosti celice. Z namenom, da bi opredelili morebitni značilni čas medmolekulskih interakcij v zaključni stopnji uravnavane eksocitoze, bomo izmerili latenco med vsidranjem mobilnih mešičkov in izločenjem njihove vsebine.
Pomen za razvoj znanosti
Sfingozin, naravni znotrajcelični metabolit, in njegov mimetik fingolimod (FTY720) zavirata mobilnost astrocitnih mešičkov in sekrecijo prenašalcev glije s povečanjem [Ca2+]i. Astrociti, najštevilčnejši tip celic glije v možganih sesalcev zagotavljajo metabolno podporo nevronom, souravnavajo sinaptično aktivnost in mikropretok krvi v možganovini. Poškodbe nevronov zaradi okužb, mehanske travme, avtoimunskih odzivov in nevrodegenerativnih bolezni praviloma aktivirajo astrocite, ki vstopijo v proces astroglijoze. Proliferirajoči astrociti lahko omejujejo širjenje vnetnih celic, popravijo poškodovano krvno-možgansko bariero, zamejijo poškodbe tkiva in njihovo velikost ter zmanjšajo izgube nevronov in obseg demielinizacije. Motnje v astrocitnih funkcijah praviloma vodijo v disfunkcijo nevronov in nastanek različnih bolezenskih stanj vključno z multiplo sklerozo. Ključni proces kemične signalizacije med astrociti in sosednjimi možganskimi celicami je uravnavana eksocitoza, med katero se zlijeta membrana sekrecijskega mešička in plazmalema; vsebina vskladiščena v lumnu mešička se difuzijsko izloči v zunajcelični prostor. Astrociti izločajo različne kemične prenašalce kot so L-glutamat, D-serin, ATP, sekrecijski peptidi, tumorski nekrotični dejavnik ?, interlevkini in prostaglandini, ki lahko igrajo ključno vlogo tudi v napredovanju bolezenskih stanj živčnega sistema. Pokazali smo, da sfingozin in FTY720 (v nefosforilirani obliki), zavreta uravanavano eksocitozo prenašalcev glije tako, da zavreta mobilnost astrocitnih mešičkov (peptidergičnih, glutamatergičnih in endosomov/lizososmov) in preprečujeta njihovo učinkovito interakcijo z mesti sidranja/zlivanja na plazmalemi. V raziskavi smo nadalje raziskali znotrajcelične signalne poti, ki so udelžene v zaviranju sekrecije prenašalcev glije. Razkrili smo vzročno povezavo med spremenjeno homeostazo citosolnega kalcija in mobilnostjo astrocitnih mešičkov zaradi delovanja nefosforiliranih, biološko aktivnih sfingolipidov. Z lipidi izzvano povečanje [Ca2+]i je sovpadalo z zmanjšano mobilnostjo peptidergičnih mešičkov, kar smo neodvisno potrdili v astrocitih, v katerih smo izzvali prehodno povečanje [Ca2+]i z draženjem glutamatnih in purinskih receptorjev v plazmalemi. FTY720 in sfingozin sta izzvala dolgotrajno povečanje [Ca2+]i v prisotnosti in odsotnosti zunajceličnih Ca2+. Z uporabo farmakoloških blokatorjev smo razkrili, da sta aktivacija fosfolipaze C in IP3 receptorjev potrebna in zadostna za povečanje [Ca2+]i, ki jo izzovejo lipidi. Eksogeni, sfingozinu podobni lipidi tako izzovejo kompleksne, od Ca2+-odvisne učinke, ki vplivajo na strukturo citoskeleta in zmanjšajo mobilnost mešičkov, ki je sklopljena z mikrotubulskim citoskeletom. Selektivno zaviranje eksocitoze v astrocitih lahko vodi v zmanjšanje z astrociti posredovanih toksičnih učinov na nevrone in posledično upočasnitev poteka bolezni. Eno od ključnih vprašanj, ki ostaja neodgovorjeno, je ali lahko FTY720 izzove podobne učinke tudi v bolnikih, ki dolgotrajno uživajo FTY720. Pričakovana terapevtska doza FTY720 v krvni plazmi je v rangu nanomolov, čeprav postaja jasno, da lahko FTY720 v možganovini doseže mikromolarno koncentracijo, še posebej na žilno-astrocitni meji, zaradi lipofilne narave zdravilne učinkovine. Lokalna koncentracija FTY720 je tako lahko zelo povečana in doseže koncentracijo, ki izzove zmanjšanje mobilnosti astrocitnih mešičkov in zavre njihovo sekrecijsko aktivnost. Izboljšanje simptomatike multiple skleroze po dolgotrajnem uživanju FTY720 je tako lahko delno posledica spremenjene fiziologije astrocitov.
Pomen za razvoj Slovenije
Nova metoda (platforma) za iskanje biološko aktivnih molekul, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov na podlagi analize mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z bolezenskimi stanji Metoda za proučevanje bioloških učinkov sestavin serumov in cerebrospinalne tekočine na posameznih evkariontskih celicah s specifično obarvanimi znotrajceličnimi organeli. Evkariontsko celico v kulturi lahko izpostavimo hidrofilnim ligandom, ki delujejo po vezavi na receptorje v plazmalemi in aktivirajo znotrajcelične signalne poti, ali lipofilnim molekulam, ki prehajajo preko plazmaleme in posredno ali neposredno vplivajo na mobilnost znotrajceličnih organelov zaradi delovanja na citoskelet in/ali na verjetnost spontanega ali izzvanega zlivanja vsidranih mešičkov ter sprostitev njihove vsebine v zunajcelični prostor. V okviru projekta smo pripravili vlogo za patentno varstvo. Po prijavi nacionalnega patenta na Uradu RS za intelektualno lastnino, dne 11.7.2011, smo v letu 2012 vlogo razširili z mednarodno patentno prijavo. Zahtevo za podelitev mednarodnega patenta smo vložili 24.04.2012 na Svetovno organizacijo za intelektualno lastnino (World Intellectual Property Organization - WIPO) v Ženevi pod številko PCT/EP2012/001759. Patent je bil skupaj s poročilom o poizvedbi objavljen 17.01.2013 pod številko objave: WO/2013/007325. V letu 2013 je bila veljavnost patenta na Svetovni organizaciji za intelektualno lastnino podaljšana. V mesecu februarju 2014 je bila vložena tudi vloga za podelitev patenta v Združenih državah Amerike.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
