Projekti / Programi
Priprava in validacija terapevtskih plazmidov brez selekcijskega gena za antibiotično rezistenco za gensko terapijo raka z inducibilnimi in tkivno specifičnimi promotorji
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.04.00 |
Medicina |
Onkologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B200 |
Biomedicinske vede |
Citologija, onkologija, kancerologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
genska terapija, rak, plazmidna DNA, gen za antibiotično rezistenco, tkivno specifični promoterji, inducibilni promoterji, horizontalni genski prenos, elektroporacija
Raziskovalci (27)
Organizacije (4)
Povzetek
Izhodišče in predstavitev problema. S povečanim znanjem o človeškem genomu in tehnološkim napredkom na področju molekularne biologije hitro napreduje tudi razvoj genske terapije, vključno z gensko terapijo raka in razvojem DNA cepiv. Eden izmed glavnih ciljev raziskovalcev genske terapije ali DNA cepiv je razvoj varnega in učinkovitega sistema za prenos genov v tarčne celice. To namreč še vedno predstavlja eno od glavnih ovir v razvoju različnih pristopov genske terapije in je ključen dejavnik za uspešnost terapije. Drugi dejavniki, ki jih je potrebno upoštevati pri razvoju genske terapije, so izbira ustreznega terapevtskega gena, regulacija njegovega izražanja in način vnosa. V predlaganem projektu bomo preučevali dva izmed teh dejavnikov. To sta varnost plazmidne DNA s pripravo plazmidne DNA brez rezistence na antibiotik in regulacija izražanja terapevtskega gena s povezavo terapevtskega gena na celične promotorje z namenom doseči gena z indukcijo stresa ali fiziološko regulacijo izražanja. Poleg tega bomo določevali tudi možnost horizontalnega genskega prenosa med rekombinantnimi plazmidi, trangenimi bakterijami in bakterijami naravno prisotnimi v organizmu.
Naša hipoteza je, da so plazmidi, ki kodirajo terapevtske gene pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev ter so brez gena za antibiotično rezistenco, varni vektorji z reguliranim izražanjem za uporabo v genski terapiji
Metode dela. Plazmidi, ki kodirajo za reporterske ali terapevtske protein pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev bodo pripravljeni s standardnimi molekularno biološkimi metodami in po navodilih proizvajalca plazmida ORT. S to tehnologijo bomo proizvedli namreč plazmide brez gena za antibiotično rezistenco. Primerne bakterijske seve bomo transformirali s pripravljenimi plazmidi in proizvedli večje količine plazmidnih DNA brez endotoksina, ki jih bomo uporabili v nadaljnjih poskusih. Horizontalni genski prenos bomo določali s PCR testom in ostalimi standardnimi laboratorijskimi postopki, tudi za pripravo biofilmov.
Učinek pripravljenih plazmidov na delovanje različnih celičnih kultur bom spremljali s testom proliferacije, antiagiogeneze in testom za določevanje metastatskega potenciala.
Na tumorskih modelih in vivo bomo določili protitumorsko delovanje pripravljenih plazmidov, ter opavili histološko analizo tumorjev. Protitumorsko delovanje bomo določali s testom zaostanka v rasti ter testom lokalne kontroli rasti tumorjev.
Izvajanje projekta. Projekt se bo izvajal v laboratorijih pri vseh 5 sodelujočih partnerjih, kjer je za izvajanje eksperimentalnega dela zagotovljena vsa raziskovalna oprema za molekularno biološke tehnike, za celične kulture, za imunocitokemične preiskave in testiranje protitumorskega učinka na tumorskih modelih. Raziskovalci na projektu imajo bogate izkušnje na področju priprave plazmidov, uporabe elektroporacije za vnos različnih molekul v celice in tkiva, kot so citotoksična zdravila in nukleinske kisline, ter radiobiologije.
Vodenje in koordinacija projekta se bo izvajala z neposrednimi kontakti z udeleženci na projektu in rednimi delovnimi sestanki.
Relevanca in potencialni vpliv rezultatov. Predlagan projekt je zasnovan kot predklinični projekt, ki obravnava pomembne teme na področju varne uporabe genske terapije v kliničnih okoljih. Rezultati projekta, če bo uspešen, lahko imajo vpliv na planiranje in izvajanje kliničnih študij genske terapije ne samo v Sloveniji, ampak tudi širše.
Pomen za razvoj znanosti
Razvoj učinkovitega in varnega sistema za vnos transgenov v tarčne celice še vedno predstavlja enega od primarnih ciljev raziskovalcev na področju genske terapije raka. Idealna metoda genskega prenosa bi podpirala vnos dovolj velike koncentracije DNA v tarčne celice z minimalnimi nezaželenimi stranskimi učinki. Elektroporacija, kot način vnosa plazmide DNA, se je pokazala kot dobra alternativa virusnim načinom vnosa. Raziskave, ki smo jih izvedli znotraj projekta, so bile nadaljevanje našega dosedanjega dela in so obravnavale pomembne teme na področju varne uporabe genske terapije v kliničnih okoljih. Uspešno smo pripravili terapevtske plazmide s tkivno specifičnimi promotorji brez gena za odpornost proti antibiotikom. Tako pripravljeni plazmidi so v skladu z navodili Evropske agencije za zdravila in Ameriške agencije za hrano in zdravila in so primerni za planiranje in izvajanje kliničnih študij genske terapije. Poleg tega so rezultati študije, ki smo jo izvedli na področju horizontalnega genskega prenosa doprinesli k natančnejšemu ocenjevanju tveganja za izvajanje kliničnih študij s trenutno dostopnimi plazmidi in so v pomoč tudi različnim državnim inštitucijam pri podeljevanju dovoljenj za izvajanje kliničnih študij.
Pomen za razvoj Slovenije
Tehnologija priprave plazmidov brez gena za odpornost proti antibiotikom se je izkazala za uspešno, zato nameravamo nadaljevati s kliničnimi študijami tudi z uporabo drugih terapevtskih genov. Priprava plazmidne DNA za klinične študije mora biti v skladu z natančnimi predpisi in mora biti pripravljena v skladu z dobro proizvodno prakso (GMP).Na osnovi naših rezultatov in rezultatov pridobljenih v okviru drugih projektov naše programske raziskovalne skupine lahko pripravimo podlago za ustanovitev spin-off podjetja za pripravo GMP plazmidne DNA, ki bi nudilo podporo potencialnim kupcem v Sloveniji in Evropi pri pripravi kliničnih študij. Poleg tega, morda bodo izsledki projekta celo zanimivi za farmacevtske in biotehnološke družbe. Če bo izsledke in produkte projekta možno patentirati, bomo pripravili in vložili patentne prijave in zascitili intelektualno lastnino ter navezali stike s potencialnimi uporabniki patentov. V okviru projekta smo pripravili evkariontski ekspresijski plazmid za izražanje humanega IL-12, katerega izražanje je uravnano z inducibilnim promotorjem p21 brez gena za odpornost proti antibiotikom za katerega bomo vložili patentno prijavo. Rezultate raziskovalnega projekta smo predstavili na mednarodnih konferencah, poletnih šolah in v obliki znanstvenih člankov. Na ta način smo promovirali našo državo kot visoko tehnološko družbo z inovativnim znanjem.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
