Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Uporaba kombinacije tehnike naslednje generacije določevanja nukleotidnih zaporedij in metagenomske analize v diagnostiki pojava hmeljeve zakrnelosti

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
4.03.01  Biotehnika  Rastlinska produkcija in predelava  Kmetijske rastline 

Koda Veda Področje
B225  Biomedicinske vede  Rastlinska genetika 

Koda Veda Področje
4.04  Kmetijske vede in veterina  Kmetijska biotehnologija 
Ključne besede
metagenomika, transkriptom, RNA-seq, bioinformatika, tehnologije sekvenciranja naslednje generacije, hmelj, Humulus lupulus L., rastlinske bolezni, diagnostika, epidemiologija
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (17)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  16324  dr. Janez Demšar  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2011 - 2014  340 
2.  24785  Alenka Ferlež Rus  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  128 
3.  31143  Nataša Hren    Tehnični sodelavec  2011 - 2014 
4.  16379  dr. Jernej Jakše  Rastlinska produkcija in predelava  Vodja  2011 - 2014  700 
5.  05994  dr. Branka Javornik  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  1.293 
6.  23044  Gregor Leskošek  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  175 
7.  31918  dr. Aljaž Majer  Rastlinska produkcija in predelava  Mladi raziskovalec  2011 - 2014  26 
8.  26537  dr. Stanislav Mandelc  Farmacija  Raziskovalec  2011 - 2014  73 
9.  34401  Mitar Milutinović  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2012  16 
10.  20162  dr. Sebastjan Radišek  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  627 
11.  31175  Gregor Rot  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2011 - 2014  45 
12.  32017  Tina Svetek  Rastlinska produkcija in predelava  Mladi raziskovalec  2011 - 2014 
13.  19184  dr. Nataša Štajner  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  331 
14.  30142  dr. Marko Toplak  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2011 - 2012  27 
15.  15577  Nevenka Valič  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  89 
16.  12536  dr. Blaž Zupan  Računalništvo in informatika  Raziskovalec  2011 - 2014  533 
17.  23195  Silvo Žveplan  Rastlinska produkcija in predelava  Raziskovalec  2011 - 2014  198 
Organizacije (3)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0416  Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije  Žalec  5051762000  4.279 
2.  0481  Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta  Ljubljana  1626914  67.218 
3.  1539  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za računalništvo in informatiko  Ljubljana  1627023  16.686 
Povzetek
Leta 2006 so pridelovalci hmelja v Savinjski dolini opazili pojav rastlin, ki so izražale izrazita znamenja zakrnelosti pri več sortah ('Celeia', 'Aurora' in 'Bobek'). Okužene rastline so dosegle le 50% normalne višine, kar se je stopnjevalo še v naslednjem letu in pripeljalo do popolnega propada. Opazovanja v okuženih nasadih so razkrila vzorec širjenja bolezni v smeri obdelave, kar nakazuje, da agrotehnični ukrepi v nasadu povzročajo širjenje na zdrave rastline, čeprav ne moremo izključiti možnosti prenosa bolezni z insekti ali ostalimi vektorji. Izmenjava okuženega sadilnega materiala med pridelovalci hmelja je povzročila nove izbruhe bolezni na ostalih območjih. Kot vir širjenja na nova neokužena območja in nastanek novih izbruhov, je bil potrjen okužen sadilni material.Fitopatologi so do sedaj opravili več diagnostičnih analiz, ki so izključile glive ter ogorčice kot potencialne povzročitelje. Prav tako so bile simptomatične rastline negativne ob testiranju na viruse ter pozitivne na prisotnost hmeljevega latentnega viroida (HLVd), ki pa ne povzroča tovrstnih bolezenskih znamenj. Simptomi opisane zakrnelosti so podobni okužbam hop stunt viroida (HSVd), ki je bil odkrit in opisan na Japonskem, ni pa širše razširjen v ostalih hmeljarskih deželah. Zakrnele rastline v Sloveniji so bile večkrat testirane z RT-PCR metodo specifično za detekcijo HSVd, vendar ni bilo potrjenih pozitivnih signalov, ki bi kazali na prisotnost omenjenega viroida. Agresivnost in resnost opisane bolezni in hitrost njenega širjenja zahteva hitro ukrepanje. V predlogu tega projekta želimo izvesti več nalog, ki bodo omogočile hitro identifikacijo patogena, razvoj metode za njegovo rutinsko detekcijo, primerjati transkriptomski odgovor okuženih in neokuženih rastlin in izdelati smernice za pravilno ravnanje z boleznijo in za njeno omejitev. Za odkritje patogena predlagamo uporabo metagenomskega pristopa primerjave nukleotidnih zaporedij v povezavi z naslednjimi generacijami določevanja zaporedij (NGS). Tako bomo lahko identificirali neznane patogene prisotne v rastlinah hmelja, ki kažejo znake zakrnelosti. Do sedaj je bilo objavljenih več uspešnih primerov uporabe kombinacije NGS in metagenomike v diagnostiki bolezni ljudi, živali in rastlin, zato menimo, da bo ta postopek omogočal hitro identifikacijo patogena oz. pokazal sinergistično okužbo z večimi patogeni. Glede na identificirano zaporedje patogena bomo razvili metodo, ki bo omogočala njegovo rutinsko detekcijo. V nadaljevanju bomo preučili tudi epidemiološke značilnosti bolezni. Te bodo usmerjene k temu, da ugotovimo ali plevelne rastlinske vrste v hmeljiščih lahko služijo kot vir ohranjanja in širjenja novega patogena in ali se nov patogen lahko širi v hmeljišču preko mehanskih poškodb. Obenem z identifikacijo patogena imamo namen raziskati razlike v izražanju posameznih genov v transkriptomih treh skupin testnih rastlin: 1) rastline z izrazitimi bolezenskimi znamenji nove bolezni in HLVd okužbom 2) rastline brez bolezenskih znamenj in HLVd okužbo in 3) rastline brez HLVd in virusov (zdrave rastline). Za razumevanje mehanizmov odziva gostitelja na virusno okužbo na molekularnem nivoju je potrebno identificirati genske transkripte, ki se ob okužbi s povzročiteljem bolezni pojavljajo v višjem ali nižjem številu kot sicer. Za izvedbo te študije bomo izvedli RNA-seq analizo opisanih vzorcev rastlin, ki bo vključevala tudi de novo zlaganje hmeljenga transkriptoma. RNA-seq so že močno pripomogle k izboljšanju razumevanja izražanja in regulacije genomov, kljub dejstvu, da so bile razvite šele pred nekaj leti. Predpostavljamo, da bo v našem primeru predlagana kombinacija metagenomske analize NGS podatkov in RNA-seq študija privedla do uspešne identifikacije novega hmeljnega patogena ali pokazala sinergistično delovanje večih patogenov in nam hkrati omogočala natančen vpoggled v bolezenski transkriptom hmeljne rastline.
Pomen za razvoj znanosti
V okviru projekta se je za proučitev do sedaj neznane bolezni na hmelju prvič uporabila metagenomska analiza s tehnologijo sekvenciranja naslednje generacije (NGS). V okviru teh aktivnosti smo določili nukleotidno zaporedje tako celokupni RNA kot tudi frakciji malih RNA. Analiza rezultatov je omogočila pridobitev specifičnih bioinformatskih veščin in osvojitev praktičnega dela z izbranimi programskimi paketi. Omenjena analiza je omogočila odkritje citrus bark cracking viroida (CBCVd) v obolelih rastlinah, kar je prvi tovrsten opis tega viroida na hmelju in hkrati prvi pojav izven območij dežel, kjer pridelujejo agrume. Analiza malih RNA je pokazala na možnost uporabe takih podatkov v rutinski diagnostiki, saj je pristop tudi cenovno zelo ugoden. Nova analiza detekcije je tako bistveno nadgradila do sedaj uveljavljene pristope odkrivanja povzročiteljev neznanih bolezni v smeri hitrejše, občutljivejše in celovitejše analize. Prav tako je NGS pristop omogočil pridobitev detajlnega transkriptoma hmelja s širšo uporabnostjo pri raziskavah odziva rastlin hmelja na okužbe z omenjenimi patogeni. Njegova analiza je potrdila določene transkripte, ki so različno izraženi med obolelimi rastlinami. Pri interakcijah viroid/virus-rastlina je znano, da rastlinski imunski odtziv generira znatne količine viroidnih/virusnih malih RNA. Le–te bi lahko utišale preko RNA interferenčne poti rastlinske gene. V naši analizi, ki je temeljila na bioinformatskem pristopu določevanja tarč v transkriptomu hmelja in nadaljnem preverjanju z RT-qPCR smo pokazali, da se geni različno izražajo v primerjavi z brezviroidnimi rastlinami, medtem ko popolnega vzorca utišanja nismo zasledili. Epidemiološke študije projekta so dopolnile dosedanje dognanja o širjenju viroidov na hmelju ter omogočile razvoj priporočenih ukrepov preprečevanja tovrstnih bolezni. Z namenom disiminacije so v projektu pridobljena nukleotidna zaporedja na voljo drugim raziskovalnim skupinam preko javno dostopne podatkovne zbirke NCBI SRA.
Pomen za razvoj Slovenije
Pridelovanje hmelja v Sloveniji je ena izmed pomembnih kmetijskih dejavnosti in ena redkih dejavnosti z izrazito izvozno usmeritvijo, saj slovenski hmeljarji izvozijo okoli 95% pridelka. V Savinjski dolini in drugod po Sloveniji pridelujejo svetovno znane visoko aromatične doma vzgojene hmeljne sorte (komercialno ime za značilne slovenske sorte hmelja je Super Styrian), ki rastejo in dajejo optimalen pridelek samo na tem področju zaradi specifičnih mikroklimatskih rastnih razmer. Pojav nove do sedaj še neidentificirane bolezni, ki se hitro širi neodvisno od sorte, resno ogroža domačo pridelavo hmelja in povzroča visoko gospodarsko škodo. V okviru projekta smo z uporabo novih raziskovalnih pristopov neposredno prispevali k identifikaciji povzročitelja ter proučili epidemiološke lastnosti na osnovi česar smo pridelovalcem postavili strategije preprečevanja širjenja. V okviru projekta smo razvili nove diagnostične metode, kar ima aplikativno vrednost pri vzgoji novih sort, zagotavljanju zdravega sadilnega materiala in nadzoru širjenja. Rezultati dela in razvoja ter vpeljave identifikacijskih tehnik in pristopov v okviru projekta imajo tudi širši pomen, saj so uporabni za reševanje podobnih problematik pojavljanja novih bolezni na področju rastlinske pridelave in tudi širše. Poznavanje odziva transkriptoma rastline na viroidno okužbo nam omogoča poleg pridobivanja bazičnega znanja tudi uporabo le-teh pri strategijah obrambe pred viroidi. Rezultati raziskave vplivajo na pridobivanje novega znanja na Univerzi v Ljubljani in Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije ter posledično na vključevanje tega znanja v nove tehnologije v domačem prostoru ter tudi v širšem evropskem oziroma svetovnem prostoru. Novi tehnološki pristopi lahko odločilno vplivajo na manjšo obremenitev okolja, varnejšo hrano, manjšo porabo energije in s tem na kvalitetnejši trajnostni razvoj. Izvedba projekta je omogočala tudi opravljanje raziskave podiplomskemu in dodiplomskemu študentu, tako je imelo neposreden vpliv na pedagoški proces na Univerzi v Ljubljani. Pridobljeni nukleotidni podatki pa omogočajo neposredno uporabo v dodiplomskem učnem procesu.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Letno poročilo 2012, 2013, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, 2013, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Zgodovina ogledov
Priljubljeno