Projekti / Programi
Preučevanje vloge biosinteze holesterola med embriogenezo ter spermatogenezo s transgenimi mišjimi modeli za gen Cyp51
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 4.02.01 |
Biotehnika |
Živalska produkcija in predelava |
Genetika in selekcija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| B220 |
Biomedicinske vede |
Genetika, citogenetika |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 4.02 |
Kmetijske vede in veterina |
Znanost o živalih in mlekarstvu |
holesterol, de novo biosinteza, Cyp51, pogojna transgeneza, embriogeneza, spermatogeneza, naravna imunost, TLR, rast in razvoj, plodnost, zdravje
Raziskovalci (15)
Organizacije (3)
Povzetek
OZADJE
Na področju živalske biotehnologije in biomedicine je pred desetimi leti s tehnologijo pogojnega izničenja genov, ki omogoča tkivno in časovno kontrolo inaktivacije poljubnega gena, prišlo do pomembnega napredka. Uporaba te tehnologije v kombinaciji z novejšimi eksperimentalnimi pristopi (»omikami«) omogoča poglobljeno razumevanje bioloških procesov in vivo ter razvoj novih industrijsko aplikativnih področij. Kljub dolgoletnim raziskavam na področju biologije holesterola, in vivo vloga vseh genov vključenih v sintezo holesterola še vedno ni raziskana. V naši raziskovalni skupini smo razvili mišje modele za pogojno izničenje enega izmed ključnih genov v biosintezi holesterola, ki je poznan tudi tudi kot potencialna tarča zdravil za zniževanje krvnega holesterola. V okviru opisanega projekta načrtujemo natančno karatkerizacijo naših mišjih modelov z izničenim genom Cyp51, ki bo prispevala k napredku temeljnega in aplikativnega področja znanosti o holesterolu.
CILJI
Projekt je zasnovan s tremi glavnimi cilji, ki temeljijo na analizi naših transgenih mišjih modelov. Prvi cilj je določiti posledice popolnega izničenja gena Cyp51 na de novo sintezo holesterola med razvojem zarodka. Drugi cilj je osredotočen na študij posledic tkivno specifične inaktivacije Cyp51 v spolnih celicah med spermatogenezo. Testirati želimo hipotezo o pomembni vlogi CYP51 ter njegovih sterolnih produktov FF-MAS in T-MAS med razvojem spolnih celic in mejozo. Tretji cilj je ugotoviti učinke popolnega ali delnega izničenja gena Cyp51 na imunski sistem. Hipoteza, ki jo bomo testirali v tem sklopu predvideva, da imajo posamezniki z okvarami v de novo sintezi holesterola moten prirojen imunski sistem, ki vodi v povečano občutljivost na infekcije in kronična vnetna stanja.
ANALITSKI PRISTOPI
Vsi trije eksperimenti temeljijo na uporabi transgenih živalskih modelov, ki smo jih razvili v našem laboratoriju. Živalski model za prvi in tretji eksperiment je že v celoti pripravljen in primeren za nadaljne študije, kar so potrdile tudi naše preliminarne analize. V nadaljevanju bomo izvedli številne fenotipske analize zarodkov, testisev, ter imunskih celic in organov. Molekularno-biološki eksperimenti bodo zajemali DNA, RNA, proteinski nivo, analizo sterolnih intermediatov ter različne teste odzivnosti agonistov »Tool like receptorjev« pri aktivaciji prirojenega imunskega sistema. Visoko-zmogljivostne mRNA analize embrijev bodo razkrile globalne spremembe v genskem izražanju po izničenju gena Cyp51. Različne sete podatkov bomo na koncu združili s pristopi funkcijske genomike.
RAZISKOVALNA SKUPINA
V tem projektu želimo združiti genetske vire in izkušnje dveh skupin, članic Univerze v Ljubljani (UL), ter skupine iz Kemijskega inštituta (KI, Ljubljana). Prijavitelj in vodja projekta (S. Horvat, UL, Biotehniška Fakulteta (BF)) s svojo skupino strokovno pokriva področje živalske transgeneze, genomike ter karakterizacije živalskih modelov. Damjana Rozman (UL, Medicinska Fakulteta (MF)) je strokovnjakinja s področja Cyp51, homeostaze holesterola in tehnologije mikromrež. Roman Jerala (KI) bo prispeval dolgoletne izkušnje s področja molekulske imunologije. Menimo, da je sodelovanje treh kompatibilnih raziskovalnih skupin, izkušenih na različnih področjih, najprimernejši način za uspešno izvedbo opisanega projekta.
POMEN
Predlagani eksperimenti so del splošnega področja »funkcijska genomika za zdravje«, ki je prioritetna tematika ministrstva za visoko šolstvo, znanost in tehnologijo (MVZT), javne agencije za raziskovalno dejavnost (ARRS) ter evropskih okvirnih programov (FP). Predvidevamo, da bodo naši transgeni živalski modeli zanimivi za širšo mednarodno raziskovalno skupnost, zato pričakujemo vzpostavitev novih sodelovanj in projektov znotraj sheme EU FP. Menimo, da bo predlagan projekt bistveno pripomogel tudi k splošni promociji slovenske znanosti.
Pomen za razvoj znanosti
Napredek v temeljnih znanjih Ugotavljamo, da so izsledki naših raziskav bistveno pripomogli k razumevanju biologije holesterola, predvsem na področju embriologije, reprodukcije ter molekularne imunologije. Zaradi interdisciplinarne narave projekta bodo rezultati koristni tudi za splošna področja, kot je genetika, funkcijska genomika, živalska biotehnologija ter molekularna biologija. Rezultati posameznih delovnih sklopov so podrobno opisani v točki 3, zato jih bomo v tej točki povzeli le na kratko. Prvi eksperiment je razjasnil pomen Cyp51 in de novo sinteze holesterola pri razvoju zarodka in pokazal kateri organi, tkiva in procesi so v primeru okvare gena Cyp51 prizadeti. Drugi eksperiment je razkril kakšna je vloga Cyp51 in določenih intermediatov (MAS sterolov) na razvoj spolnih celic in posledično plodnosti. Pridobljeno znanje je lahko zelo koristno tudi pri interpretaciji ostalih biosintetskih poti, kjer se pojavlja enak fenomen. Tretji poskus je potrdil hipotezo o pomembni vlogi de novo biosinteze holesterola pri imunskem odzivu. Naša publikacija v eminentni reviji Cell metaoblism je sploh prva pokazala, da so intermediati biosinteze holesterola lahko direktni ligandi endogenih genov (v našem primeru gen RORgama t) in imajo torej pomembno biološko funkcijo. Ta vezava je nujna za signaliziranje in normalen razvoj limfocitov ter posledično delovanje imunskega sistema. Ti rezultati so spremenili trenutni pogled na vpletenost biosinteze holesterola v razvojne procese (npr delovanje imunskega sistema, zorenje spolnih celic), ter izpostavili funkcijsko vlogo intermediatov (MAS) pred pomenom samega končnega produkta biosintetske poti (holesterol). Razvoj genetskih virov. Zelo pomemben produkt tega projekta je razvoj edinstvenih genetskih virov za bodoče študije homeostaze holesterola. Kot je opisano v točki 3 smo že vzpostavili povezave s številnimi interesenti iz Evrope, da bi genetske vire tega projekta vključili tudi v obsežnejše bodoče projekte. Naš transgeni mišji model so medtem že uporabljeni v številnih študijah po svetu in tudi pri projektu FP7 za študij mehanizma in zdravljenje nealkoholne bolezni zamaščenih jeter. To je kompleksna motnja, ki se pojavlja pri 30 milijonih Evropejcev in lahko napreduje v usodno obliko nealkoholne steatoze. Vsi trije transgeni živalski modeli razviti tekom projekta bodo koristni tudi za prihodnje študije povezane s homeostazo holesterola, ki bodo dolgoročno pripomogle k izboljšanju kvalitete življenja ljudi in živali. Razvoj novih tehnologij: V preteklih štirih letih je naša raziskovalna skupina v Slovenski prostor vpeljala tehnologijo ciljnega spreminjanja genov pri miših. Vzpostavili smo tehnologijo matičnih embrionalnih celic ter laboratorij za vzrejo transgenih miši. Transgena mišja linija uporabljena v tem projektu, je prvi genetsko spremenjeni model miši, ki je bil razvit v Sloveniji brez sodelovanja tujih znanstvenikov. Osvojili smo tehnologijo razvoja transgenih živalskih modelov, v tem projektu pa še razvili funkcijsko karakterizacijo teh modelov za in vivo funkcionalne študije. Menimo, da je projekt bistveno prispeval k nadaljnjemu razvoju tehnologije transgenih živalskih modelov v slovenskem prostoru in uporabi teh modelov na področju funkcijske genomike.
Pomen za razvoj Slovenije
Korist za zdravje ter kvaliteto življenja ljudi in živali Projekt J4-4306 je bil sicer zasnovan kot temeljni, zato ni vključeval partnerjev in sponzorjev iz industrije. Menimo pa, da številni rezultati tega nudijo dobro osnovo za načrtovanje aplikativne projektov na področju iskanja novih zdravil za zniževanje krvnega holesterola, zdravljenje neplodnosti ter zdravljenje zmanjšanja imunske odzivnosti in vnetnih bolezni. V bodoče nameravamo vzpostaviti stik z ustreznimi podjetji v Sloveniji, ki bi jih zanimal prenos znanja pridobljenega znotraj tega projekta pri razvoju novih produktov predvsem na področju biomedicine in zdravja živali. Rezultati prvega poskusa bodo služili kot osnova za aplikativne raziskave povezane z okvarami biosinteze holesterola med razvojem ljudi in živali. Ena od možnih aplikacij je diagnostika za identifikacijo sindromov homeostaze holesterola povezanih z okvarami v Cyp51. Kljub poznavanju usodnih posledic genetskih mutacij (npr: hiperholesterolemija zaradi mutacije Ldlr pri prašičih), pogosto posvečamo premalo pozornosti pomenu raziskav za zdravje ter kvaliteto življenja živali in ljudi. Naša študija je prinesla nova orodja (biomarkerje) in znanja s katerimi bo mogoče raziskovati učinke Cyp51 in biosinteze holesterola na embrionalni razvoj živali (prenatalne smrti) ter nepravilnosti pri odraslih živalih. Drugi eksperiment je prinesel številne nove informacije o vlogi Cyp51 in MAS pri regulaciji zorenja moških spolnih celic. Te so lahko dobra podlaga za aplikativne študije, ki bodo pripomogle k razlagi nepojasnjenih vzrokov številnih primerov moške neplodnosti ter njihovemu zdravljenju. Naš pilotni tretji poskus je jasno pokazal, da imajo osebki z okvarami v homeostazi holesterola tudi okvare v odzivnosti imunskega sistema. Nadaljnje aplikativne študije lahko raziščejo, če se takim osebkom lahko uvede terapijo z dieto ali s farmakološko terapijo. Promocija slovenske znanosti Glavni cilj našega projekta je bil prispevati znanje in pristope k boljšemu zdravju in kvaliteti življenja ljudi in živali, kar je pravzaprav tudi glavna prioriteta razvite družbe. Uporaba novih in vivo transgenih modelov v kombinaciji z najnovejšimi tehnologijami (“omikami”) je najbolj obetaven raziskovalni pristop k funkcijski genomiki. S tem projektom smo se Slovenci pridružili svetovnim trendom na tem področju saj je bila Slovenija na področju funkcijske genomike in uporabe transgenih modelov v svetovnem merilu še nepoznana. Da je pričujoči projekt prispeval k večji prepoznavnosti Slovenije pričata tudi odmevnost naših publikacij ter izredno zanimanje za transgene modele, ki smo jih razvili znotraj tega projekta. Naše linije miši smo poslali po svetu na akademske ali industrijske inštitucije na praktično vse kontinente razen Afrike. Zaradi povečanega obsega dela pri distribuciji teh genetskih virov nam bo sedaj pomagalo največje podjetje na področju vzreje in prodaje laboratorijskih živali, The Jackson Laboratory v ZDA. To podjetje je prevzeli vse stroške transportov in tudi krioprezervacije, to je zamrzovanja zarodkov ter sperme naših linij kot varnostno rezervo v njihovi genski banki pomembnih linij. Izobraževanje kadrov Posredni pomen projekta za družbo je tudi v zaposlovanju in izobraževanju novih sodelavcev, ki bodo pri projektu sodelovali. V okviru projekta sta bila zaključena dva doktorata, vključeni so bili tudi številni diplomanti na prvi in drugi bolonjski stopnji. Oba doktoranda sta zaradi dobrih publikacij dobila službo – žal res v tujini predvsem zaradi trenutne krize zaposlovanja mladih raziskovalcev v Sloveniji.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
