Projekti / Programi
Oligomeri amiloidogenih proteinov od a do ž; biofizikalne lastnosti, struktura, funkcija in medsebojne interakcije
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 7.00.00 |
Interdisciplinarne raziskave |
|
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B000 |
Biomedicinske vede |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.07 |
Naravoslovne vede |
Druge naravoslovne vede |
tri-dimenzionalna struktura, prepletanje dimer, amiloidna vlakna, amiloidna toksičnost, nevrodegeneracija, stefini, cistatini, alfa-sinuklein, proteinsko zvitje, interakcija z membranami, šaperonski efekt
Raziskovalci (13)
Organizacije (3)
Povzetek
Oligomeri proteinov, ki so nagnjeni k tvorbi fibril, so povezovalna tema tega projekta, ki sega preko raznih disciplin, od strukture višjih (od tetramere) oligomer, njihove vloge v kinetiki in termodinamiki procesa tvorjenja amiloidnih fibril, novih fiziko-kemijskih lastnosti oligomer, interakcij oligomer z membranami in med seboj (interakcija proteina s peptidom) in celični fenomeni ki so posledica proteinske oligomerizacije in agregacije, kot na primer avtofagija in oksidativni stress. Če navedem več podrobnosti: poskušali bomo določiti 3D strukturo ene višje oligomere stefina B (višje od tetramere) z metodo kristalografije in podprto s heteronukearnim NMR. Nadalje bomo z uporabo spektroskopskih metod in kalorimetrije – DSC - določili stabilnost oligomer, dimer, tetramer in višjih v primerjavi z monomero. Z merjenjem časovnega poteka reakcij in s pripravo ustreznih mutant bomo določili vlogo posameznih prolinov v pri kinetiki fibrilacije in oligomerizacije. Pogledali bomo tudi, kako se spremeni konformacija oligomer ob membranah in kako vplivajo na permeabilnost membrane. S površinsko plasmonsko resonance – SPR - bomo merili interakcijo protein: protein med oligomeri stefina B (ali b- mikroglobulina) in drugimi amiloidnimi peptide kot sta a-sinuklein (ali amilin). Študirali bomo pretežno oligomere stefina B – kot dober model (obstajajo protokoli, kako jih pripraviti), a ne samo te. Kot primerjavo bomo študirali druge proteine: a-sinuklein, kot predstavnika naravno odvitih proteinov, ki gradi Levijeva telesca pri Parkinsonovi bolezni, ataksin, ki je prestavnik proteinov s poliglutaminskimi ponovitvami in verjetno še enega dodatnega predstavnika globularnih proteinov poleg stefina B - b2-mikroglobulin, ki se nalaga v sklepih in kosteh pacientov na dolgotrajni hemodializi. Študijem mehanizmov in strukture bomo dodali študije na celičnih kulturah, z namenom, da razjasnimo celične procese, ki spremljajo proteinsko agregacijo. Cistatini, vključno s stefinom B so udeleženi pri pomembnih fizioloških procesih in aleli njihovih genov lahko povečajo tveganje za Alzheimerjevo bolezen (AD). Na primer, pokazali so, da alel B cistatina C vodi do oviranega izločanja tega sekretornega proteina in poveča tveganje za AD. Nedavno so objavili študijo, da ima cistatin C neko vlogo pri avtofagiji, katera je glavni način, kako se proteinski agregati čistijo iz celice. Za stefin B, katerega mutacije povzročajo progresivno mioklonsko epilepsijo tipa 1 (EPM1), so poročali, da zmajša oksidativni stres in celično smrt (apoptozo), oziroma da se tadva procesa povečata, če stefin B ni prisoten v celicah. Pred kratkim so tudi poročali, da stefin B zmanjša avtofagijo, da torej ta proces boljše poteka v celicah KO miši, kar je izboljša siceršnjo patologijo pri enem modelu miši za AD. Poleg vsega naštetega je stefin B udeležen pri izvorni imunosti, na še nepojasnjen način. Mnogi od teh efektov so neodvisni od katepsinov in predstavljajo druge, alternativne funkcije cistatinov kot je inhibicija proteaz. Študij celičnih efektov oligomer in njihova interakcija z membranami tako stefin a B in EPM1 mutant kot tudi ?-sinukleina in njegovih mutant, ki povzročajo familiarno PD, ima neposredni pomen za medicino in sicer molekularno in translacijsko medicino (Polajnar & Žerovnik, članek v tisku v Trends in Molecular Medicine). Ta interdisciplinarni projekt povezuje discipline, ki segajo od strukturnih, molekularnih in celičnih lastnosti prefibrilarnih oligomer do morebitne funkcije in patofiziologije. Naš project z naslovom: “Oligomeri amiloidogenih proteinov od a do ž; biofizikalne lastnosti, struktura, funkcija in medsebojne interakcije” spada v peti prioritetni sklop ARS in EU programa: zdravje in znanost o življenju in meddisciplinarne raziskave na področju naravoslovno-tehniških in biotehniških, farmacevtskih in medicinskih ved.
Pomen za razvoj znanosti
Naše študije so bazične narave, a so orientirane v razumevanje molekularnih osnov nevrodegenerativnih bolezni kot je npr. Alzheimerjeva bolezen (AD), Parkinsonova bolezen, amiotropična lateralna skleroza (ALS), idr. Študije EPM1 mutant stefina B pa prispevajo k razumevanju vsaj dela patologije te progresivne mioklonične epilepsiji, ki je tudi delno nevrodegenerativna bolezen. Pričakujemo, da bo več znanja o lastnostih oligomer amiloidogenih proteinov dolgoročno pripomoglo v iskanju terapije za nevrodegenerativne bolezni. Namreč, oligomeri amiloidogenih proteinov so se izkazali za toksične in so najverjetneje glavni igralci v patološki kaskadi v AD in drugih nevrodegenerativnih boleznih. Interakcija z membranami (taki oligomeri delajo pore v membrane) predstavlja možni mehanizem citotoksičnosti. Ker struktura oligomer ni znana, pravtako ni znana konformacija ob membranah, so to trenutno zelo pereča vprašanja. Izviren je naš namen, da bi določili doslej nepreskušene biofizikalne lastnosti amiloidnih oligomer in fibril kot so optične in električne lastnosti. Kdo bi lahko vprašal, zakaj so stefini dober model za študij zvijanja in agregacije? Prvič, znane so 3D strukture tako stefina A in B in pred kratkim je bila določena struktura tetramere stefina B (1), pravtako je znan model za strukturo fibril (2). Naša grupa je stefine dodobra preštudirala, tako njihovo stabilnost, zvitje in tvorbo amiloidnih fibril, ki pri stefinu B poteka pod milimi – fiziološko relevantnimi pogoji, v primerjavi z stefinom A ali cistatinom C. Študirali smo tudi vpliv sekvence (s pripravo himernih stefinov) in vlogo nekaterih ohranjenih prolinov, kar smo vse opisali v preglednem članku v reviji Biochimie (3). 1. nova osnovna znanja in potencialno uporaba za translacijsko medicino Modelne študije, posredno pojasnjujejo molekularne mehanizme nevrodegenerativnih bolezni (9-10). Mehanizem proteinske agregacije do amiloidnih fibril in toksičnost, ki jo povzročajo predvsem topni oligomeri in prefibrilarni agregati, sta dve najbolj pereči vprašanji današnje nevroznanosti. Danes obstaja prepričanje, da so celični vključki-agresomi ali ektracelične lehe manj toksični kot so topne oligomere. 2. Drugi družbeno-ekonomskimi dosežki C.06: članstvo v uredniškem odboru specialistične revije Amyloid : Žerovnik, Eva (member of editorial board 2005-). Carnforth: Parthenon. ISSN 1350-6129. [COBISS.SI-ID 512143641] Amyloid, the international journal of experimental and clinical investigation. Časopis “International Society of Amyloidosis” G Učinki aplikativnih raziskav G.01 / G.01.02 Razvoj podiplomskega izobraževanja 1.Uvajanje novega raziskovalnega področja in predmeta na podiplomskem izobraževanju MPŠ Jožefa Stefana. Ima dva predmeta na podiplomskem študiju http://www.mps.si/splet/studij.asp?lang=slo&main=1&left=4&id=457&m=4 Je nosilka izmenjave ERASMUS s Tehnično univerzo v Talinu, Estonia G.09 Osnovne raziskave za zdravje in iskanje novih terapij: „Molekularna medicina” Pregledni članek z naslovom: Protein Conformational Pathology in Alzheimer's and Other Neurodegenerative Diseases; New Targets for Therapy, je izšel v Current Alzheimer’s Research (CAR)(11). Povezava s privatno kliniko in farmacevtskim sektorjem IRCCS Institute, Brescia študira vlogo cistatina C kot faktorja tveganja za Alzheimerjevo bolezen. Želijo si te študije razširiti tudi na stefin B (tudi imenovan cistatin B) kot morebiten rizični faktor za Alzheimerjevo in frontotemporalno demenco. S to privatno kliniko sodelujemo že vrsto let in smo prijavili več EU projektov, nazadnje ITN Marie Curie projekt. Tudi LEK Pharmaceuticals d.d., (Novartis, Sandoz group) del multinacionalne farmacevtske družbe se zanima za take študije.
Pomen za razvoj Slovenije
Stefin B pa ni le odličen model za študije mehanizma amiloidne fibrilacije in toksičnosti, ki bi ga smeli posplošiti na številne druge globularne proteine, predvsem tiste, ki tvorijo prepletene dimere, ampak je tudi fiziološko pomemben protein. V letu 2010 smo objavili študij interakcije stefina B v oligomerni obliki s amiloidom-beta tako in vitro kot ko-lokalizacijo v celici - kar postavlja stefin B direktno v povezavo z Alzheimerjevo boleznijo (4). Poleg tega so (Lehtinen et al. 2009) poročali, da se v KO celicah brez stefina B poveča oksidativni stres (5) in pa, da cistatin C pospešuje avtofagijo (6). Avtofagija je proces, ki proteinske agregate odtranjuje iz celice in ima pomembno vlogo pri nevrodegenerativnih boleznih. Odsotnost stefina B izboljša patologijo modela AD (7-8), kar nadalje kaže na potrebo po razumevanju nove funkcije tega proteina. Funkcija stefina B ni povsem pojasnjena, bolj ali manj znano je, da ima dodatne funkcije poleg inhibicije proteaz. Nepojasnjena je vloga stefina B pri preprečevanju oksidativnega stresa in izvorni (innate) imunosti. Ena možna funkcija, ki smo jo predlagali, je šaperonska, da oligomeri vežejo amiloidne peptide in preprečujejo njihovo agregacijo. Če bi se izkazalo, da EPM1 mutante nimajo enake funkcije vezave amiloida-beta, bi to imelo implikacije za patologijo EPM1. Podobno bi imela vezava ?-sinukleina na oligomere stefina B pomembne implikacije za Parkinsonovo bolezen. Celične študije se neposredno navezujejo na dejansko patologijo tako AD kot EPM1. Markerji proteinske agregacije, ki jih predvidoma povzročajo agregati stefina B in predvsem določene EPM1 mutante (določali smo markerje za oksidativni stres in avtofagijo) bi lahko bili skupni med EPM1 in nevrodegenerativnimi boleznimi (POLAJNAR, Mira, ŽEROVNIK, Eva. Impaired autophagy : in common to neurodegenerative diseases and progressive myoclonal epilepsis. Trends mol. med., IF (2009) = 11.049) (9). Podobna sugestija velja za nevropsihiatrične bolezni (10). 1. Jenko Kokalj, S., et al. Essential role of proline isomerization in stefin B tetramer formation. J Mol Biol 366, 1569-1579 (2007). 2. Morgan, G.J., et al. Exclusion of the native alpha-helix from the amyloid fibrils of a mixed alpha/beta protein. J Mol Biol 375, 487-498 (2008). 3. Zerovnik, E., Staniforth, R.A. & Turk, D. Amyloid fibril formation by human stefins: Structure, mechanism & putative functions. Biochimie 92, 1597-1607 (2010). 4. Skerget, K., et al. Interaction between oligomers of stefin B and amyloid-beta in vitro and in cells. J Biol Chem 285, 3201-3210 (2010). 5. Lehtinen, M.K., et al. Cystatin B deficiency sensitizes neurons to oxidative stress in progressive myoclonus epilepsy, EPM1. J Neurosci 29, 5910-5915 (2009). 6. Tizon, B., et al. Induction of autophagy by cystatin C: a mechanism that protects murine primary cortical neurons and neuronal cell lines. Plos One 5, e9819. 7. Kaur, G. & Levy, E. Cystatin C in Alzheimer's disease. Front Mol Neurosci 5, 79 (2012). 8. Kaur, G., et al. Cystatin C rescues degenerating neurons in a cystatin B-knockout mouse model of progressive myoclonus epilepsy. Am J Pathol 177, 2256-2267. 9. Polajnar, M. & Zerovnik, E. Impaired autophagy: a link between neurodegenerative diseases and progressive myoclonus epilepsies. Trends Mol Med 17, 293-300 (2011). 10. Polajnar, M. & Zerovnik, E. Impaired autophagy: a link between neurodegenerative and neuropsychiatric diseases. J Cell Mol Med (2014). 11. Zerovnik, E. Protein conformational pathology in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases; new targets for therapy. Curr Alzheimer Res 7, 74-83 (2010).
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
2013,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
