Projekti / Programi
Strukturna razlaga visokega dviga encimske aktivnosti sekretornih fosfolipaz A2 v kompleksu s kalmodulinom z NMR visoke ločljivosti.
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.05.00 |
Naravoslovje |
Biokemija in molekularna biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| P351 |
Naravoslovno-matematične vede |
Strukturna kemija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.04 |
Naravoslovne vede |
Kemija |
sekretorna fosfolipaza A2, kalmodulin, neesencielni aktivator, nevrotoksičnost, kompleks, tridimenzionalna struktura, NMR
Raziskovalci (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
25628 |
dr. Lidija Kovačič |
Biokemija in molekularna biologija |
Vodja |
2011 - 2013 |
82 |
Organizacije (1)
| št. |
Evidenčna št. |
Razisk. organizacija |
Kraj |
Matična številka |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
0106 |
Institut "Jožef Stefan" |
Ljubljana |
5051606000 |
90.812 |
Povzetek
Sekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2) so fosfolipolitični encimi, katerih encimska aktivnost je udeležena v številnih patofizioloških procesih pri sesalcih – na primer pri vrojeni imunosti, aterosklerozi, vnetnih boleznih, rasti celic, pri apoptozi, odstranjevanju poškodovanih celic, raku, sindromu akutne dihalne stiske, endotoksičniemu šoku, sproščanju nevrotransmiterjev, nevritogenezi, embriogenezi, bolečini, ishemiji in pri Alzheimerjevi bolezni. Očitno je, da je natančna regulacija delovanja teh encimov zelo pomembna za naše zdravje. Amoditoksin (Atx), nevrotoksična sPLA2 iz skupine IIA, tvori visoko-afinitetni kompleks s kalmodulinom (CaM), regulatornim proteinom v citosolu evkariontskih celic. Atx pridobi v kompleksu s CaM občutno višjo encimsko aktivnost, tako v neredukcijskih kot, še posebej pomembno, v redukcijskih, citosolu-podobnih pogojih. Ob interakciji s CaM pride do strukturne stabilizacije Atx, vendar ta ni vzrok dvig encimske aktivnosti. Na podlagi kartiranja interakcijske površine med molekulama in podatkov mutageneze Atx smo zgradili energijsko najbolj ugoden model kompleksa Atx–CaM. Na osnovi tega modela smo ugotovili, da CaM povzroči podobne učinke tudi v primeru njemu homolognih, fiziološko zelo pomembnih sesalskih encimov, sPLA2 iz skupin V in X. Po prepričljivi demonstraciji, da sPLA2 molekule lahko obstajajo in delujejo tudi v citosolu sesalskih celic, smo podali hipotezo, da CaM sodeluje pri regulaciji fosfolipazne aktivnosti v celicah. Da bi lahko nadalje analizirali vlogo CaM pri regulaciji encimske aktivnosti sPLA2 v citosolu, potrebujemo natančno tridimenzionalno atomsko strukturo kompleksa sPLA2–CaM. V okviru predlaganega projekta bom v ta namen uporabila NMR spektroskopijo visoke ločljivosti, metodo, ki nam lahko poleg tridimenzionalne strukture poda še informacijo o dinamičnih spremembah kompleksa na fosfolipidni membrani, kar se odrazi v visokem dvigu encimske aktivnosti sPLA2. Detajlna tridimenzionalna struktura kompleksa bo omogočila usmerjeno načrtovanje mutant, bodisi sPLA2 ali CaM, ki jih bomo nato uporabili pri raziskavah patofiziološkega pomena znotrajcelične aktivnosti sPLA2 v sesalskih celicah. Za CaM je znano, da se veže le na točno določene strukturne elemente v proteinih, na tako imenovane kanonske motive. Atx pa v svoji strukturi ne vsebuje nobenega od znanih CaM-vezavnih motivov pa kljub temu veže CaM z zelo visoko afiniteto. Predpostavljamo, da vsebuje novega, še nedoločenega. Z rešitvijo tridimenzionalne strukture kompleksa Atx–CaM, bom novi CaM-vezavni motiv v molekuli Atx nedvoumno definirala. Sledilo bo iskanje drugih proteinov, ki vsebujejo enak CaM-vezavni motiv kot Atx in nato raziskava vloge CaM v biologiji teh proteinov. Pričakujem, da bodo pozitivni rezultati predlaganega projekta imeli visok vpliv na izboljšanje človeškega zdravja.
Pomen za razvoj znanosti
SPLA2s so encimi, ki so vpleteni v številne patofiziološke procese v sesalskih organizmih. Njihovo zunaj celično delovanje je bilo že detajlno raziskovano, medtem, ko so raziskave vnosa teh molekul v celico in njihovo delovanja v citosolu vse bolj v ospredje potem, ko smo in vitro dokazali relativno stabilnost teh encimov v citosolu-podobnih pogojih ter in vivo demonstrirali vezavo AtxA na CaM v citosolu nevronske celice. Odkritji stabilizacije in visokega dviga encimske aktivnosti s CaM pri AtxA in nekaterih človeških sPLA2 odkrivata možen nov način regulacije teh encimov. Poznavanje natančne interakcijske površine CaM v kompleksu s sPLA2 omogoča racionalno načrtovanje mutacij v molekuli CaM, kar je ključnega pomena za nadaljnje raziskave patofiziološkega pomena sPLA2 znotraj sesalskih celic. Znano je, da CaM intereagira s proteini preko točno določenih strukturnih elementov v proteinih, t.i. CaM-vezavnih motivov. S pomočjo NMR in modeliranja smo odkrili, da se sPLA2 veže na CaM z novim kanonskim CaM-vezavnim motivom, kar posledično privede do strukturnih sprememb v molekuli CaM, ki so drugačne, kot je do sedaj znano v literaturi za kanonske CaM-vezavne molekule. Naši rezultati omogočajo tako iskanje novih CaM-vezavnih molekul. Na podlagi rezultatov smo napovedali in tudi in-vitro preverili delovanje manjšega interferirajočega peptida z imenom MLCKP, ki je preprečil vezavo sPLA2 na CaM in posledično tudi dvig in stabilizacijo encimske aktivnosti sPLA2. Na podlagi tega peptida lahko v prihodnje načrtujemo nove učinkovine, ki predstavljajo nov načinov posredovanja in nadzora teh regulatornih poti v sesalskih celicah. Te molekule so izjemnega pomena za naše zdravje v procesih kot so so prirojena imunska pomanjkljivost, ateroskleroza, vnetne bolezni, proliferacija celic, apoptoza, odstranjevanje poškodovanih celic, rak, akutni dihalni sindrom, endotoksični šok, sproščanje nevrotransmitorjev, nevritogeneza, embriogeneza, bolečina, ishemija in Alzheimerjeva bolezen.
Pomen za razvoj Slovenije
Raziskovalni projekt imel kar nekaj posrednih pozitivnih učinkov na našo družbo. Te so bile zlasti pri prenosu znanja pridobljenega na Nizozemskem v Slovenijo ter na področju izobraževanja. Preko raziskovalnih aktivnosti so moje znanstvene in profesionalne izkušnje rasle, svoje znanje ter izkušnje pa sem prenesla na študente. Kot asistentka na fakulteti sem bila vključena v poučevanje dodiplomskih študentov na Univerzi v Ljubljani. V okviru raziskav se je izobraževal en dodiplomski in en podiplomski študent. Rezultate naših raziskav smo in nekatere še bomo objavili v kvalitetnih mednarodnih znanstvenih revijah in monografijah. S predstavljanjem svojih dosežkov sem v obliki vabljenih predavanj in v obliki postrov predstavila na številnih mednarodnih znanstvenih srečanjih in tako dodala k prepoznavnosti in znanstvenem ugledu Slovenije v svetu. Posebnega pomena za slovenski raziskovalni prostor in preko njega za celotno družbo je bilo uvajanje v program HADDOCK, NMR tehnika in v druge najnovejše raziskovalne tehnologije, ki sem jih uporabila pri svojem raziskovalnem delu.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2011,
2012,
zaključno poročilo,
celotno poročilo na dLib.si
