Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Načrtovanje in karakterizacija alosteričnih modifikatorjev cisteinskih katepsinov

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
1.05.00  Naravoslovje  Biokemija in molekularna biologija   

Koda Veda Področje
P310  Naravoslovno-matematične vede  Beljakovine, encimologija 

Koda Veda Področje
1.06  Naravoslovne vede  Biologija 
Ključne besede
alosterična regulacija, cisteinski katepsini, razvoj zdravil
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (1)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  26028  dr. Marko Novinec  Biokemija in molekularna biologija  Vodja  2011 - 2013  221 
Organizacije (1)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0103  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo  Ljubljana  1626990  23.454 
Povzetek
Človeški cisteinski katepsini spadajo v družino papainu podobnih cisteinskih peptidaz, njihove vloge v različnih fizioloških in patoloških procesih pa so bile predmet številnih raziskav. Sprva so bili poznani kot lizosomski encimi, katerih primarna vloga je nespecifična razgradnja proteinskih substratov v lizosomih, danes pa je znano, da poleg te opravljajo še mnoge druge, specifične fiziološke funkcije. Regulacija cisteinskih katepsinov z endogenimi kompetitivnimi inhibitorji je bila podrobno preučena, malo pa je znanega o alosterični regulaciji teh encimov. Alosterija je sklopljenost konformacijskih sprememb med dvema ločenima mestoma v proteinu in je pomemben mehanizem regulacije številnih proteinov. Alosterična mesta proteinov postajajo čedalje pogostejše tarče v razvoju novih zdravil, saj lahko s takimi zdravili natančno uravnavamo aktivnost njihovih tarč. V tem projektu bomo okarakterizirali mehanizme alosterične komunikacije v cisteinskih katepsinih in načrtovali nove alosterične modifikatorje teh encimov za uporabo in vitro ter in vivo. Domneva se, da alosterična komunikacija v proteinih poteka preko ohranjenih omrežij aminokislinskih ostankov. Mi bomo identificirali taka omrežja v cisteinskih katepsinih z uporabo računalniškega algoritma, imenovanega statistična analiza sklopitve. Na podlagi teh rezultatov bomo napovedali lokacije možnih alosteričnih mest. Naši primarni tarči bosta katepsina K in B. Obema je bilo v zadnjih desetletjih posvečene mnogo pozornosti, ker sodelujeta pri razvoju različnih bolezni. Katepsin K je ključna peptidaza pri razgradnji kostnega tkiva in je ena glavnih tarč za zdravljenje osteoporoze, katepsin B pa sodeluje v procesih preoblikovanja tkiv, ki so povezani z razvojem osteoartitisa in raka. Potencialne alosterične modifikatorje bomo identificirali in silico, tako da bomo po knjižnicah komercialno dostopnih spojin poiskali spojine, ki se lahko vežejo na alosterična mesta. Identificirane spojine bomo nabavili ter izčrpno testirali njihov vpliv na aktivnost tarčnih encimov. V primerjavi z inhibitorji, ki se vežejo v aktivno mesto, od alosteričnih modifikatorjev pričakujemo mnogo širši spekter delovanja, saj lahko vplivajo na aktivnost, stabilnost ali druge lastnosti tarčne molekule. Potencialne spojine bomo zato skrbno preučili ter določili njihovo aktivnost in specifičnost, poseben poudarek pa bo namenjen mehanizmu in kinetiki njihovega delovanja. Najučinkovitejše modifikatorje bomo okarakterizirali s strukturnega vidika, tako da bomo določili kristalne strukture kompleksov encim-modifikator, njihovo aktivnost pa bomo testirali tudi v celičnih kulturah. Naš končni cilj je pripraviti modifikatorje, ki bodo sposobni natančno uravnavati aktivnost katepsinov K in B. Takšne spojine bi lahko služile kot idealni terapevtiki, saj lahko z njihovo uporabo znižamo prekomerno aktivnost encimov nazaj na nivo, ki je nujno potreben za normalno delovanje organizma.
Pomen za razvoj znanosti
Pomen našega projekta za razvoj znanosti lahko ocenjujemo z dveh vidikov, in sicer z vidika novosti v uporabljeni metodologiji ter z vidika znanstvene vrednosti projekta. Glede na uporabljeno metodologijo, je ta projekt eden prvih, kjer je bila uspešno uporabljena kombinacija računalniških metod tako za napovedovanje alosteričnih mest kakor tudi za načrtovanje modifikatorjev, ki se na ta mesta vežejo. Glede na svojo vsebino, ima projekt veliko znanstveno vrednost, saj predstavlja velik korak naprej v razumevanju mehanizmov regulacije delovanja cisteinskih katepsinov na molekulskem nivoju. Pomembnost alosterične regulacije številnih encimov v različnih bioloških procesih je izdatno dokumentirana, vendar pa do sedaj pri cisteinskih katepsinih še ni bila resno preučena. Ta projekt je prvi, ki se je neposredno ukvarjal s tematiko obstoja in pomena mehanizmov alosterične regulacije pri teh encimih. Identificiran inhibitor katepsina K NSC13345 je prvi znan alosterični inhibitor cisteinskih katepsinov. Spojina ima vse teoretične lastnosti dobrega alosterična inhibitorja, ki jih v praksi redko najdemo. Je specifična za katepsin K, sposobna pa je tudi specifično zavreti razgradnjo kolagena kot najpomembnejšega substrata ne da bi pri tem izničila aktivnost encima na drugih substratih. To je dobro izhodišče za nadaljnji razvoj učinkovin na njeni osnovi ter seveda v znanstvene namene. Podobno velja tudi za vsaj nekaj od preostalih identificiranih inhibitorjev. V celoti gledano je projekt predstavil svež pristop v preučevanju mehanizmov delovanja proteinov in je nedvomno vzorec za podobne študije drugih proteinov v prihodnosti.
Pomen za razvoj Slovenije
Rezultati našega projekta so neposredno zanimivi za farmacevtsko industrijo, ki je trenutno ena izmed najbolje stoječih gospodastvenih panog v Sloveniji. Cisteinski katepsini, kakor tudi številne druge peptidaze, so namreč zelo zanimive tarče za razvoj zdravil. Nekaj inhibitorjev katepsina K je trenunto v klinični fazi testiranja kot zdravila proti osteoporozi. Alosterični inhibitorji predstavljajo alternativo trenutno uporabljanim inhibitorjem, ki se vežejo v aktivno mesto encima, racionalen pristop k njihovem načrtovanju, predstavljen v tem projektu, pa je mnogo bolj ekonomičen kot naključno skeniranje knjižnic spojin ter obenem manj podvžen napakam. Nasplošno postajajo bolezni, povezane s prekomerno aktivnostjo peptidaz, kakršne so osteoporoza, artritis, ateroskleroza, ipd. vedno večji zdravstveni problem moderne družbe, tudi slovenske. Zaradi možnosti uporabe za zdravljenje teh bolezni, imajo rezultatov našega projekta potencial prispevati k izboljšanju zdravja in s tem kvalitete življenja prebivalcev Slovenije. Na akademskem področju je projekt okrepil naše sodelovanje z raziskovalnimi skupinami iz tujine, saj smo pri izvedbi tesno sodelovali s tremi uglednimi raziskovalnimi skupinami, in sicer s prof. Antonijem Baicijem (Univerza v Zürichu, Švica), ki spada med najboljše strokovnjake na področju encimske kinetike ter prof. Rama Ranganathanom (Univerza v Texasu, Dallas, ZDA) in prof. Amedeom Caflischem (Univerza v Zürichu, Švica), ki spadata med največje svetovne strokovnjake na področju bioinformatike in računalniške biokemije. Pri teh sodelovanjih smo se naučili novih eksperimentalnih in računskih metod, ki se v Sloveniji pred tem niso uporabljale. Zaradi tega je projekt pripomogel tudi k razvoju Katedre za biokemijo na UL FKKT kot neodvisne raziskovalne skupine, ki se ukvarja z moderno znanostjo. Nova znanja in izkušnje se odražajo na povišani kvaliteti izobraževanja, ki ga prenašamo na študente naše fakultete. Ti so tako iz prve roke seznanjeni s kvalitetnimi raziskavami, omogočeno pa jim je tudi sodelovanje v njih.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Zgodovina ogledov
Priljubljeno