Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Načrtovanje novih inhibitorjev bakterijskih Mur ligaz in dinamični model encima MurD iz E. coli

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
1.09.00  Naravoslovje  Farmacija   

Koda Veda Področje
B740  Biomedicinske vede  Farmakološke vede, farmakognozija, farmacija, toksikologija 

Koda Veda Področje
3.01  Medicinske in zdravstvene vede  Temeljna medicina 
Ključne besede
Antibiotiki, protibakterijske zdravilne učinkovine, bakterijski peptidoglikan, bakterijske Mur ligaze, inhibitorji encimov, strukturno podprto načrtovanje, načrtovanje na osnovi strukture ligandov, virtualno rešetanje, molekulske simulacije, molekulska dinamika, in vitro testiranje, strukturne študije
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (1)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  25493  dr. Andrej Perdih  Farmacija  Vodja  2011 - 2013  270 
Organizacije (1)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0104  Kemijski inštitut  Ljubljana  5051592000  21.078 
Povzetek
Odkritje antibiotikov, ki so človeštvu priskrbeli učinkovito orožje za boj proti bakterijskim okužbam, stoji v areni zgodovine kot eden izmed veličastnih triumfov znanosti. Evolucijski pritisk in neskrbna prekomerna uporaba protibakterijskih zdravilnih učinkovin sta vzrok, da so bakterije razvile učinkovite mehanizme rezistence na antibiotike. V zadnjih dvajsetih letih so identificirali veliko bakterijskih sevov, ki izkazujejo odpornost na mnoge antibiotike in obstoječe stanje kaže na nujnost pospešenega iskanja novih protibakterijskih učinkovin. Peptidoglikan je ključna bakterijska makromolekula, ki omogoča integriteto in preživetje prokariontske celice v različnih osmolarnih okoljih. Med že poznanimi in na novo identificiranimi potencialnimi tarčami so encimi, ki sodelujejo v biosintezi bakterijskega peptidoglikana, zanimive tarče zaradi možnosti doseganja selektivne toksičnosti. Sinteza peptidnega dela monomerne enote peptidoglikana poteka intracelularno preko sukcesivnega dodajanja aminokislin na začetni UDP-prekurzor (UDP-MurNAc), ki ga katalizirajo encimi, imenovani Mur ligaze (MurC, MurD, MurE in MurF). V okviru podoktorskega projekta se bomo ukvarjali z družino bakterijskih Mur ligaz, ki je bila že v preteklosti predmet naših raziskav. Tako bomo do sedaj razviti dinamični model encima MurD nadgradili in razširili. Natančno bomo ovrednotili energetske spremembe, povezane z veliko fleksibilnostjo (odpiranjem in zapiranjem) encima MurD. S tem bomo identificirali vmesne strukture, ki so encimu lažje dostopne in tako razvili kvantitativne kriterije, ki bodo omogočili uporabo teh struktur pri načrtovanju novih MurD inhibitorjev z upoštevanjem fleksibilnosti proteinske tarče. Vse pridobljene podatke, ki bodo dopolnili naš dinamični model, bomo validirali z dostopnimi eksperimentalnimi podatki. Postavljen dinamični model in dostopne eksperimentalne rezultate bomo uporabili pri načrtovanju in iskanju novih inhibitorjev bakterijskih ligaz. Tak kompleksen pristop k načrtovanju učinkovin spada med novosti na področju načrtovanja biološko aktivnih molekul. Poslužili se bomo tudi klasičnih prijemov načrtovanja in virtualnega rešetanja z uporabo statičnih proteinskih struktur. V obeh primerih bomo uporabili široko paleto dostopnih metod: tehnike konstrukcije farmakoforov na osnovi ligandov, na strukturi temelječe farmakofore, tehnike virtualnega rešetanja na osnovi prileganja oblike in orodja molekulskega sidranja. Načrtovane spojine bomo ovrednotili v testih encimske aktivnosti (v sodelovanju z raziskovalno skupino Fakultete za farmacijo), kar bo omogočilo direktno validacijo hipotez ter izboljšave obstoječih modelov ter na koncu identifikacijo učinkovitih inhibitorjev ligaz z optimalnimi lastnostmi za nadaljni razvoj. V povezavi z raziskovalno skupino na Institut de Biologie structurale Jean-Pierre Ebel (CNRS) v Grenoblu, Francija bomo pričeli tudi s kristalizacijskimi eksperimenti, da bi določili kristalne strukture kompleksa izbranega encima Mur ligaze z inhibitorjem. Rezultati, pridobljeni v okviru podoktorskega projekta, bodo razširili razumevanje delovanja encimov bakterijske družine Mur ligaz na atomskem nivoju. Aplikacija rezultatov dinamičnega modeliranja in uporaba statičnih modelov za virtualno rešetanje bosta omogočili identifikacijo novih učinkovitih inhibitorjev bakterijskih ligaz kot potencialnih protibakterijskih zdravilnih učinkovin. S tem bomo v okviru podoktorskega projekta pridobili nova spoznanja, ki bodo pomagala v boju proti rezistentnim bakterijam.
Pomen za razvoj znanosti
Podoktorski projekt Z1-4111: Načrtovanje novih inhibitorjev bakterijskih Mur ligaz in dinamični model encima MurD iz E. coli je obravnaval raziskave novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin in teoretično obravnavo encima MurD. V naših raziskavah smo v prvi fazi z uporabo novo razvite metode simulacije replik - off path simulation method (OPS ) uspešno dopolnili naš razviti dinamični model encima MurD z izračuni energetike, povezanimi s premiki C-terminalne domene. Prav tako smo razširili razumevanje medmolekulskega prepoznavanja inhibitorjev MurD, ki so bili načrtovani, v okviru D-Glu paradigme, z metodo linearne interakcijske energije (LIE). Objavljeni članek z rezultati OPS računov predstavlja enega prvih objavljenih aplikacij te metode. Z metodami računalniško podprtega načrtovanja smo identificirali in okarakterizirali več strukturnih razredov inhibitorjev bakterijskih Mur ligaz, primernih za nadaljnji razvoj do protibakterijskih zdravilnih učinkovin. Najpomembnejša rezultata projekta predstavljata prvi identificirani multipli inhibitorji celotne verige Mur ligaz (MurC-MurF) v nizkem mikromolarnem območju ter prvi identificirani ATP-kompetitivni inhibitor encima MurD. Pomemben metodološki znanstveni dosežek projekta Z1-4111 je tudi kompleksnejši integriran pristop k načrtovanju zdravilnih učinkovin, saj smo klasične metode strukturno podprtega načrtovanja sklapljali z dinamičnimi metodami molekulskega modeliranja, kot sta npr. molekulska dinamika in rešetanje z uporabo multiplih proteinskih struktur. Taka integrirana metodologija je trenutno redkeje prisotna v raziskovalnem procesu odkrivanja novih biološko aktivnih entitet tako zaradi daljšega časa potrebnega za izvedbo, kot relativno kratkega obdobja uporabe takega pristopa na področju načrtovanja zdravilnih učinkovin. Z novimi aplikacijami teh metod na encimih Mur ligaz smo pokazali na uporabnost razvite metodologije za pridobivanje ključnih informacij v fazi optimizacije začetnih zadetkov ter omogočili povečano razumevanje obnašanja proteinskih tarč. Izvedene študije predstavljajo nova bazična znanja, ki so nujno potrebna za boljše razumevanje bakterijskih Mur ligaz, olajšajo pa tudi nadaljnji razvoj in optimizacijo odkritih spojin v farmacevtski industriji, ki vodi do zdravilnih učinkovin na trgu, namenjenih bolnikom z zdravstvenimi težavami zaradi rezsistentnih bakterijskih infekcij. Rezultate raziskav opravljene v času trajanja projekta smo skupaj s sodelavci objavili v devetih izvirnih in treh preglednih znanstvenih člankih, nekaj člankov z rezultati projekta pa je še v procesu recenzije.
Pomen za razvoj Slovenije
Podoktorski projekt Z1-4111 je opozoril na pereč zdravstveni problem bakterijske rezistence in ponudil potencialne rešitve tako s povečanim razumevanjem delovanja bakterijskih encimov Mur ligaz kot tudi z identifikacijo novih inhibitorjev. V družbi mora biti vseskozi prisotno zavedanje, da sta iskanje in identifikacija novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin nujni za ohranjanje dosežene kvalitete življenja in učinkovitosti zdravstva na področju borbe proti patogenim bakterijam. Farmacevtska industrija v Sloveniji predstavlja zelo pomembno in uspešno gospodarsko panogo, ki vseskozi podpira in tudi financira raziskave na področju farmacije. Zato je primarnega pomena za raziskovalce v Sloveniji, ki delujejo v akademskem okolju, da v okviru svojih zmožnosti in ekspertiz razvijejo uporabne ideje na svojih raziskovalnih področjih, ki bi bile uporabne tudi za nadaljnji industrijski razvoj. V preteklosti so v Sloveniji raziskave novih protibakterijskih zdravilnih učinkovin uspešno izvajali tudi v industrijskem okolju, kar dokazujejo številne objavljene patentne prijave in podeljeni patenti industrijskim raziskovalcev. Uporabni rezultati podoktorskega projekta Z1-4111, tako novo razvite računske metodologije, ki kombinirajo statične in dinamične pristope k načrtovanju zdravilnih učinkovin, kot tudi odkrite spojine - inhibitorji Mur ligaz – tvorijo dobro osnovo za vzpostavitev nadaljnjega sodelovanja z visokotehnološkimi farmacevtskimi in biotehnološkimi podjetji in potencialno komercializacijo pridobljenega znanja tako v Sloveniji kot v tujini, kar je v skladu s smernicami razvoja slovenskega gospodarstva. Podoktorski projekt je vodji projekta tudi omogočil obisk in izvajanje raziskav na dveh uglednih raziskovalnih inštitucijah: Freie Universität Berlin, Nemčija in University of Michigan, Ann Arbor ZDA in tako krepitev raziskovalne mreže med slovenskimi in elitnimi tujimi raziskovalnimi centri. Nova znanja (»know-how«), ki smo jih pridobili tako z uporabo teoretičnih pristopov, kot tudi z izvedenimi eksperimentalnimi študijami v povezavi z vzpostavljenimi sodelovanji s Fakulteto za farmacijo v Ljubljani, FU Berlin in skupino strukturnih biologov iz CNRS v Grenoblu, predstavljajo razvojni korak naprej za področje farmacevtske kemije in načrtovanje zdravilnih učinkovin v Sloveniji. Financiranje teh raziskav dokazuje, da je Slovenija na znanju temelječa družba, ki vzpodbuja inovativen razvoj in raziskave. Posredni pomen za slovensko družbo in državo je bilo tudi večanje njenega znanstvenega ugleda, saj je vodja projekta izsledke znanstvenih rezultatov raziskav skupaj s sodelavci objavil v več uglednih mednarodnih revijah s faktorjem vpliva, aktivno sodeloval na znanstvenih srečanjih in konferencah ter imel tudi štiri vabljena predavanja. Nenazadnje je podoktorski projekt Z1-4111 pokazal na pomembnost interdisciplinarnosti in tesnega sodelovanja med raziskovalci z različnih področij za dosego istega cilja; v našem primeru večjega zdravstvenega blagostanja. Tako delovanje pošilja v družbo jasno sporočilo, da mora raziskovalna srenja stremeti k skupnemu reševanju znanstvenih izzivov ter sinergističnemu delovanju, ki presega nacionalne meje in posamezne raziskovalne ekspertize.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2011, 2012, zaključno poročilo, celotno poročilo na dLib.si
Zgodovina ogledov
Priljubljeno