Projekti / Programi
Nef, izločen z eksosomi iz celic okuženih z virusom HIV, pomembno prispeva k razvoju nevroloških simptomov AIDS-a
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B510 |
Biomedicinske vede |
Infekcije |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
HIV-1, nevrološki simptomi AIDSa, Nef, eksosomi, nanodelci, razmeščanje, biomarkerji
Raziskovalci (29)
Organizacije (5)
Povzetek
V obdobju učinkovite protivirusne terapije HAART, nevrološki zapleti AIDS-a (nevroAIDS) ostajajo nepremagljiv problem. Klinični simptomi so s HIV-om povezana demenca (HAD), blage kognitivne poškodbe (MCMD) in vakuolarna mielopatija. HAD naj bi diagnosticirali pri okoli 10%, MCMD pa pri do 30% okuženih odraslih, otroci pa so še občutljivejši na učinke HIV-a. Za izboljšanje zdravstvenega stanja obolelih je zato pomembno razumevanje še nepojasnjenih mehanizmov s HIV-om povezane nevrodegeneracije. Odkritje biomarkerjev za napovedovanje tveganja in za spremljanje napredovanja nevroAIDS-a bi izredno izboljšali zdravljenje posameznikov okuženih s HIV-om.
Znano je, da HIV v možgane vstopi s pomočjo hematopoetskih celic, ki so nato vir nadaljnih okužb možganskih celic. Glavna tarča HIV-a v možganih so mikroglije (15% vseh celic CŽS) in astrociti (do 50% CŽS volumna), sposobne polne ali le delne virusne okužbe. Vzorci otroškega možganskega tkiva in in vitro okuženih celic so pokazali, da je Negativni faktor (Nef) najmočneje izražen virusni protein v astrocitih. Raziskave kažejo na vpletenost Nef-a v nevr AIDS, vendar mehanizem ostaja nepojasnjen. Zunajcelični Nef tako vpliva na viabilnost in metabolizem mikroglij, astrocitov, oligodendrocitov in nevronov. Poveča tudi migracijo in nabiranje levkocitov v možganih. V predhodni študiji smo prvič pokazali, da Nef s pomočjo indukcije sproščanja eksosomov (veziklov s premerom od 40-100 nm), pomembno stimulira svoje izločanje iz T celic, in pri tarčnih T limfocitih in vitro povzroči celično smrt sproženo z aktivacijo. Ta fenomen smo opazili tudi v primeru infekcije primarnih T limfocitov z virusom HIV. Naše rezultate so neodvisno potrdili in še dodatno pokazali prisotnost Nef-eksosomov v krvi tako s HAART zdravljenih kot tudi nezdravljenih posameznikov.
Hipoteza predlaganega projekta je, da Nef vsebujoči eksosomi, ki se sproščajo iz s HIV-om okuženih mikroglij in astrocitov, tvorijo rezervoar bioaktivnih veziklov, ki vplivajo na viabilnost in diferenciacijo okoliških celic CŽS. Naš glavni cilj je ovrednotiti in razumeti vlogo virusnega proteina Nef pri nevroAIDS-u in oceniti primernost Nef-eksosomov iz likvorja in/ali krvi kot biomarkerjev za prisotnost tega stanja. Sprva bomo pokazali klinično pomembnost Nef-exosomov v CŽS. V ta namen bomo optimizirali metodo za izolacijo eksosomov iz vzorcev likvorja, nato pa eksosome izolirali iz likvorja in krvi s HIV-om okuženih posameznikov in določili prisotnost Nef. Za kvantikacijo eksosomov bomo razvili nov pristop na osnovi AF4-UV-MALS-QELS-RI. Ocenili bomo tudi učinek izražanja Nef-a ali okužbe celic s HIV-om na sproščanje in sestavo eksosomov pri mikroglijah in astrocitih, ter preučili vpliv inhibicije izražanja ključnih celičnih tarč z siRNA tehniko in izražanja mutiranih proteinov Nef na sproščanje. Med celicami CŽS (astrociti, mikroglije, oligodendrociti, nevroni, izvorne živčne celice) bomo nato z imunofluorescentno mikroskopijo določili tarče Nef-eksosomov, ki jih bomo nato izpostavili Nef-eksosomom in s pomočjo pretočne citometrije, imunofluorescentne mikroskopije in spektroskopskih metod ocenili učinek na apoptozo, namnoževanje in diferenciacijo celic. Nazadnje bomo razvili minimalno invazivne metode za spremljanje pojava in napredovanja nevroAIDSa. V ta namen bomo eksosome izolirane iz likvorja s HIV-om okuženih posameznikov, analizirali z masno spektrometrijo in miRNA profiliranjem s qPCR metodo terdoločili proteinsko sestavo in miRNA profil. Relevantne biomarkerje bomo preverili tudi na vzorcih krvi istih okuženih posameznikov.
Rezultati projekta bodo pomembno prispevali k razumevanju nevroAIDSa in fiziološke vloge eksosomov. Opisani bodo učinki proteina Nef na celice CŽS, kar bo pomagalo pri iskanju novih strategij pri omejitvi oziroma preprečavanju Nef-patogeneze. Vpeljana bo tudi nova metoda v diagnostiki AIDSa, pri kateri bodo Nef-eksosomi služili kot biomarkerji za spremljanje bolezni.
Pomen za razvoj znanosti
Zunajcelični vezikli so heterogena populacija membranskih veziklov s pomembno vlogo v medcelični komunikaciji, ki so iz celic v zunajcelični prostor sproščeni tako in vivo kot tudi in vitro. Izolirali so jih iz raznolikih bioloških vzorcev kot so kri, likvor, urin; ter iz kultur večine tipov sesalčjih celic. Glede na velikost in mesto nastanka v celici, zunajcelične vezikle ločimo na eksosome (30–100 nm), mikrovezikle (100–1.000 nm) in apoptotska telesca (1.000–5.000 nm). Njihova proteinska, nukleinska (miRNA) in lipidna sestava odseva sestavo celice izvora in je odvisna od trenutnega stanja celice. Posledično so zunajcelični vezikli postali pomemben vir novih biooznačevalcev za raznolika telesna stanja s pomembno diagnostično in prognostično vrednostjo, še posebno za bolezni centralnega živčevja. Raziskave potekajo tudi v smeri ciljanja zunajceličnih veziklov z zdravili za preprečevanje razvoja bolezni, njihove uporabe kot terapevtsko sredstvo ali kot dostavni sistem za zdravilne učinkovine. V okviru projekta J3-5499 smo se osredotočili na vlogo zunajceličnih veziklov, ki se v odvisnosti od virusnega proteina Nef izločajo iz možganskih celic, okuženih z virusom HIV-1, k HIV (nevro)patogenezi. Poskušali smo osvetliti mehanizem nastajanja veziklov ter mehanizem njihovih toksičnih učinkov na tarčne celice, izsledke raziskav pa uporabiti pri diagnostiki HIV-a in izboljšanja kvalitete življenja okuženih posameznikov. Naši ključni prispevki k znanosti na področjih zunajceličnih veziklov in HIV-patogeneze so: 1- Postavili smo novo metodo za določitev velikosti in kvantifikacijo populacije zunajceličnih veziklov z uporabo pretočnega sistema z asimetričnim prečnim pretokom (AF4) v kombinaciji z več-detektorskim sistemom, kar je zapolnilo vrzel na področju analize veziklov. Prednosti metode v primerjavi z obstoječimi metodami (elektronska mikroskopija, analiza NTA, pretočna citometrija) so enostavna analiza celotne populacije veziklov, določena velikost (polmer) veziklov ustreza velikosti v fiziološkemu okolju, detekcija tudi najmanjših veziklov in možnost analize velikostno heterogene populacije. 2- Prvi smo pokazali, da je splošno uporabljena metoda barvanja veziklov s fluorescentnim barvilom PKH neustrezna za funkcionalne študije veziklov. Barvilo namreč tudi v odsotnosti veziklov tvori številne micelije, ki se po velikosti ne razlikujejo od eksosomov. Ker v prisotnosti veziklov barvilo tvori še večje število micelijev, na podlagi kontrolnega vzorca ne moremo sklepati na razmerje med miceliji in vezikli v barvanem vzorcu veziklov. Prvič smo tudi pokazali, da celice micelije prevzemajo z enako učinkovitostjo kot barvane eksosome. Pred uporabo obaravanih veziklov v študijah je zato potrebno ločevanje micelijev in veziklov na sukroznem gradientu, kjer se le-ti ločijo glede na gostoto. 3- Prvi smo pokazali, da je izvor zunajceličnih veziklov lahko tudi CD81 imunopozitiven organel, ki je morfološko podoben multivezikularnemu telescu, vendar ni endosomalnega izvora, ampak se tvori iz plazemske membrane. Do sedaj sta bila opisana le dva možna izvora zunajceličnih veziklov: zlitje multivezikularnega telesca z membrano ali direktno uvihavanje plazemske membrane navzven. 4- Prvi smo pokazali, da pri polovici s HIV-om okuženih posameznikov, ki so učinkovito zdravljeni s protivirusno terapijo in zato virusne RNA v plazmi ni možno detektirati, v plazmi vsebujejo virusni protein Nef. S tem smo nakazali, da v telesu obstajajo translacijsko aktivni rezervoarji virusa, ki ne producirajo virusa, sproščajo pa Nef. Ker je Nef znan patogen dejavnik virusa HIV, bi lahko prispeval k vnetnim procesom in k z AIDS-om nepovezanimi bolezenskimi stanji, ki se pojavljajo pri učinkovito zdravljenih posameznikih. Prisotnost plazemskega Nef-a bi tako lahko uporabili kot biomarker za identifikacijo posameznikov, ki potrebujejo spremenjeno terapijo. Zaradi toksičnosti Nef-a, bi bili Nef-eksosomi lahko tudi dobra terapevtska tarča.
Pomen za razvoj Slovenije
V okviru projekta J3-5499 smo pomembno prispevali k naslednjim področjem pomembnim za razvoj Slovenije: 1- Izsledki raziskav, opisani pod točko B.9.1., so ključno prispevali k razvoju novih metodologij za analizo in študij zunajceličnih veziklov, k razumevanju mehanizmu nastanka zunajceličnih veziklov znotraj celic in k razumevanju HIV-1 patogeneze pri uspešno zdravljenih z virusom okuženih posameznikov. S tem smo pomembno prispevali k razvoju slovenske znanosti tako v splošnem kot tudi specifično na (v svetovnem merilu) zelo novem področju raziskav zunajceličnih veziklov. Rezultate raziskav smo predstavili na številnih mednarodnih kongresih in v okviru vabljenih predavanj na tujih inštitucijah in s tem prispevali k prepoznavnosti slovenske znanosti v mednarodnem znanstvenem okolju. 2- Pomembno smo prispevali tudi k dolgoročnemu izboljšanju zdravljenja in s tem kvalitete življenja posameznikov okuženih z virusom HIV-1, tako v Sloveniji kot tudi drugje v svetu. Pokazali smo namreč, da približno polovica okuženih posameznikov, ki s protivirusno terapijo uspešno vzdržuje virusno RNA v plazmi pod mejo klinične detekcije, v plazmi vsebuje virusni protein Nef. Nef je znan virusni patogen dejavnik, s številnimi negativnimi učinki. Nef v plazmi bi tako lahko prispeval k vnetnim procesom in k z AIDS-om nepovezanimi bolezenskimi stanji, ki se pogosto pojavljajo pri drugače uspešno zdravljenih okuženih posameznikih. V okviru projekta smo optimizirali test za detekcijo Nef-a v plazmi, ki bi lahko identificiral bolnike, pri katerih je potrebna sprememba terapije. Pokazali smo tudi, da bi bili lahko vezikli, ki vsebujejo Nef, pomembna terapevtska tarča. 3- Pomembno smo prispevali tudi k izboljšanju pedagoškega dela in k izobraževanju kadrov. Večina članov projektne skupine je namreč vpletena v pedagoško delo, tako na dodiplomskem študiju (Medicinska fakulteta, Biotehniška fakulteta, Zdravstvena fakulteta) kot tudi na podiplomskem študiju (podiplomski študij Biomedicina, Mednarodna podiplomska šola Jožefa Stefana). Sodelovali smo pri organizaciji mednarodne delavnice Pharmacogenomics: From Research to Clinic (2015), organizirali pa smo tudi simpozij Zunajcelični vezikli - vloga v patogenezi in klinični potencial (2016), kjer smo o tematiki zunajceličnih veziklov izobraževali tako dodiplomske, podiplomske in podoktorske študente, uveljavljene raziskovalce in klinike. Izobraževanje na področju nadaljujemo z pošiljanjem mesečnih novic glede napredka na področju zunajceličnih veziklov, napisali pa smo tudi preglednji članek na to temo v slovenskem jeziku, ki je bil objavljen v Medicinskih razgledih. Člani projektne skupine so tudi mentorji pri številnih študentskih raziskovalnih nalogah, diplomah, magisterijih in doktoratih, in nekatera izmed njih so prejela tudi naslednja priznanja: fakultetna Prešernova nagrada, Krkina nagrada, Lapanjetovo priznanje, L'Oréal-UNESCO Za ženske v znanosti.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
