Nalaganje ...
Projekti / Programi vir: ARIS

Nitroksolin in njegovi derivati kot nova protitumorska zdravila

Raziskovalna dejavnost

Koda Veda Področje Podpodročje
4.06.01  Biotehnika  Biotehnologija  Tehnologija rekombinantne DNA 

Koda Veda Področje
T490  Tehnološke vede  Biotehnologija 

Koda Veda Področje
3.04  Medicinske in zdravstvene vede  Medicinska biotehnologija 
Ključne besede
katepsin B, proteazni inhibitor, nitroksolin, rak
Vrednotenje (pravilnik)
vir: COBISS
Raziskovalci (22)
št. Evidenčna št. Ime in priimek Razisk. področje Vloga Obdobje Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  26491  dr. Maruška Budič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2014 - 2015  24 
2.  14575  dr. Maja Čemažar  Onkologija  Raziskovalec  2013 - 2016  1.427 
3.  15284  dr. Stanislav Gobec  Farmacija  Raziskovalec  2013 - 2016  837 
4.  20376  Branka Grabovac    Tehnični sodelavec  2013 - 2016 
5.  12688  dr. Kristina Gruden  Biotehnologija  Raziskovalec  2014  985 
6.  04648  dr. Janko Kos  Biotehnika  Vodja  2013 - 2016  1.158 
7.  32175  dr. Boštjan Markelc  Medicina  Raziskovalec  2013 - 2014  224 
8.  19170  dr. Urša Pečar Fonović  Farmacija  Raziskovalec  2013 - 2016  144 
9.  29966  Dejan Pelko    Tehnični sodelavec  2015 - 2016 
10.  36596  dr. Milica Perišić Nanut  Biotehnika  Raziskovalec  2014 - 2016  143 
11.  32035  dr. Anja Pišlar  Biotehnologija  Raziskovalec  2013 - 2016  166 
12.  26507  dr. Jure Pohleven  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2013  75 
13.  15813  dr. Boris Rogelj  Nevrobiologija  Raziskovalec  2013  412 
14.  23576  dr. Jerica Sabotič  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec  2013 - 2016  318 
15.  08800  dr. Gregor Serša  Onkologija  Raziskovalec  2013 - 2016  1.511 
16.  30816  dr. Izidor Sosič  Farmacija  Raziskovalec  2013 - 2015  251 
17.  36900  Jasna Šlenc  Farmacija  Raziskovalec  2014 - 2015 
18.  21619  dr. Olga Vasiljeva  Onkologija  Raziskovalec  2013 - 2016  183 
19.  35506  dr. Sabina Vatovec  Biologija  Raziskovalec  2013  29 
20.  34507  dr. Tjaša Zlobec  Biotehnologija  Mladi raziskovalec  2013 - 2015  26 
21.  17285  Darja Žunič Kotar    Tehnični sodelavec  2013 - 2016 
22.  34459  dr. Simon Žurga  Farmacija  Mladi raziskovalec  2013 - 2015  25 
Organizacije (3)
št. Evidenčna št. Razisk. organizacija Kraj Matična številka Štev. publikacijŠtev. publikacij
1.  0106  Institut "Jožef Stefan"  Ljubljana  5051606000  90.695 
2.  0302  ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA  Ljubljana  5055733000  15.468 
3.  0787  Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo  Ljubljana  1626973  17.159 
Povzetek
Katepsin B je lizosomska cisteinska proteaza, katere spremenjena aktivnost, izražanje in lokalizacija je povezana s številnimi patološkimi procesi. Najbolj raziskana je njegova vloga pri nastanku in razvoju raka, kjer ima osrednjo vlogo pri razgradnji proteinov zunajceličnega matriksa, s čimer omogoča invazijo in metastaziranje tumorskih celic ter angiogenezo. Katepsin B je edinstven med katepsini po tem, da ima eksopeptidazno in endopeptidazno aktivnost. Za razgradnjo zunajceličnega matriksa naj bi bila bistvenega pomena predvsem endopeptidazna aktivnost encima. Ker je katepsin B potrjena tarča pri zdravljenju raka, je načrtovanje in odkrivanje novih inhibitorjev katepsina B usmerjeno predvsem v iskanje reverzibilnih inhibitorjev, ki bi selektivno zavirali endopeptidazno aktivnost katepsina B. V okviru naše raziskovalne skupine smo z metodami virtualnega rešetanja, encimske kinetike in funkcijskih testov identificirali nitroksolin, ki je že uveljavljen antibiotik za zdravljenje infekcij okužb sečil, kot inhibitor katepsina B. Nitroksolin izkazuje selektivno delovanje na endopeptidazno aktivnost encima, ki jo inhibira kot reverzibilni inhibitor v nizko mikromolarnem območju. Molekula nitroksolina se veže v podmesta S' katepsina B, pri čemer aromatski kinolonski obroč tvori interakcije s podmestom S2', medtem ko nitro skupina tvori specifične interakcije s pozitivno nabitima His110 in His111 v zaporni zanki. Nitroksolin preko inhibicije endopeptidazne aktivnosti katepsina B značilno inhibira razgradnjo proteinskih substratov katepsina B in invazijo celic v in vitro modelih tumorske invazije. Na podlagi kristalne strukture kompleksa nitroksolina s katepsinom B, ki smo jo določili v predhodni študiji in rezultatov encimske kinetike, nameravamo pripraviti derivate nitroksolina, ki bodo izkazali še boljšo specifičnost vezave katepsina B in konstante inhibicije v nanomolarnem področju. Pri tem bomo uporabili metode računalniškega modeliranja in usmerjene sistematične sinteze. Ta pristop zajema zamenjavo nitro skupine z literaturno poznanimi bioizostenimi zamenjavami, uvajanje različnih substituentov na mesti 7 in 8 kinolonskega obroča ter zamenjavo heterocikla z naftalenskim obročem. Osredotočili se bomo tudi v pripravo derivatov, ki bi delovali kot reverzibilni kovalnentni inhibitorji, pri čemer bi uporabili nitrilo skupine, usmerjene v S1' mesto encima, ki bi tvorile izotioamid s tiolno skupino cisteina v aktivnem mestu. Nitroksolin in derivate, ki bodo izkazovali najboljše inhibitorne lastnosti, bomo testirali na različnih in vitro modelih adhezije, migracije in invazije tumorskih celic ter tumorske angiogeneze. Poleg že uveljavljenih testov bomo v ta namen razvili 2D in 3D tumorske modele, ki bodo veliko bolje ponazarjali dejansko in vivo stanje. Za preverjanje inhibitornih učinkov nitroksolina in njegovih derivatov na endopeptidazno aktivnost katepsina B v tumorskih celicah in posledično na mehanizme, ki vodijo do napredovanja raka, bomo uporabili različne metode fluorescenčne mikroskopije, pretočno citometrijo, in nove metode spremljanja celičnih sprememb v realnem času z merjenjem električne upornosti. Protitumorski učinek nitroksolina in njegovih derivatov bomo določali tudi in vivo na mišjih modelih rasti tumorjev in tvorbe spontanih metastaz. Pripravili bomo nanodostavne sisteme, ki bodo omogočili ciljano dostavo inhibitorjev to tumorskih celic, kar lahko še dodatno poveča njihovo biološko dostopnost in izboljša PK/PD lastnosti. Pričakujemo, da se bodo »odlične« inhibitorne lastnosti nitroksolina in njegovih derivatov odrazile v učinkovitem zmanjšanju rasti tumorjev in tvorbi metastaz, kar bi omogočilo njihovo klinično testiranje.
Pomen za razvoj znanosti
Raziskave v okviru predlaganega projekta se vključujejo v sodobne znanstvene trende na področju poznavanja delovanja proteoliznih encimov pri nastanku in napredovanju raka. Dosedanje raziskave, ki jih je opravila naša in druge skupine pri specifični regulaciji proteolitične aktivnosti katepsina B in posledično tumorigenih procesov, so odprle nova področja raziskav in v svetu vzbudile veliko zanimanja, saj so bile do sedaj velikokrat citirane v najuglednejših revijah, kar nekaj raziskovalnih skupin pa nadaljuje naše delo na tem področju. Poznavanje mehanizmov regulacije aktivnosti katepsina B omogoča razumevanje osnovnih procesov tumorigeneze in lahko pojasni dogodke, ki omogočajo tumorsko rast in tvorbo metastaz, to pa je ključno, če želimo uporabiti to proteazo kot tarčo za razvoj novih zdravil. Samo selektivna inhibicija posamezne proteaze, ki je dejansko udeležena v kvarnem patološkem procesu, lahko prinese uspeh pri zdravljenju, uporaba splošnih proteaznih inhibitorjev se je izkazala kot neprimerna, saj povzroča vrsto stranskih učinkov. Terapevtska uporaba znanih ireverzibilnih inhibitorjev katepsina B se je prav tako izkazala kot neprimerna, prvič zaradi toksičnosti in nizke biološke uporabnosti, in drugič, zaradi zmožnosti ireverzibilnih inhibitorjev da prej ali slej blokirajo tudi neciljane proteaze. Kot izvirni prispevek k znanosti lahko označimo nov mehanizem delovanja nitroksolina kot reverzibilnega inhibitorja katepsina B, ki nam je služil kot osnova za pripravo in sintezo njegovih derivatov s še boljšimi farmakološkimi lastnostmi. Učinkovitost teh spojin potrjuje hipotezo o ključni vlogi endopeptidazne aktivnosti katepsina B pri raku. Naša projektna skupina je pri raziskovalnem delu uporabljala najbolj napredne tehnike in metode, ki jih bomo lahko prenesli tudi na druga področja, prav tako pa tudi izkušnje, ki smo jih pridobili z uspešnim sodelovanjem z vodilnimi slovenskimi in svetovnimi raziskovalci.
Pomen za razvoj Slovenije
Rezultati predlaganega projekta bodo omogočili razvoj novih tehnologij in produktov, ki bodo tržno zanimivi za farmacevtska podjetja v Sloveniji. V Sloveniji in Evropski uniji sta biotehnologija in farmacija vodilni znanstveni in razvojni usmeritvi. Farmacevtska industrija dosega izjemno močan gospodarski razvoj, pri tem pa vpeljava novih proizvodov, bodisi originalnih ali generičnih, predstavlja osnovno gibalo. Le vrhunsko znanje, ki izhaja iz vrhunskih raziskav na tem področju, ji lahko omogoči razvojno prednost pred ostalimi. Poleg novih protitumorskih učinkovin so rezultat projekta tudi najsodobnejše raziskovalne tehnike in metodologije, ki so prav tako zanimive za farmacevtsko industrijo. Novi proizvodi, ki bodo lahko izhajali iz zaključenega projekta, bodo imeli veliko dodano vrednost in bodo povečevali konkurenčnost podjetij v slovenskem in evropskem prostoru. Poleg tega je doprinos projekta pomemben za vse stopnje univerzitetnega izobraževanja, saj je omogočil študentom pridobiti nova znanja, v izvedbo projekta so bila vključena tudi diplomska in doktorska dela na področju farmacevtske biokemije, biotehnologije in tumorske biologije. To je omogočila velika vpetost članov projektne skupine v pedagoške procese na javnih univerzah v Sloveniji in na Podiplomski šoli Jožefa Stefana. Izvajanje projekta je tudi ojačalo sodelovanje z drugimi raziskovalnimi skupinami, povečalo izmenjavo znanja in možnosti za pridobivanje evropskih in drugih sredstev za financiranje naše znanosti.
Najpomembnejši znanstveni rezultati Letno poročilo 2013, 2014, 2015, zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati Letno poročilo 2013, 2014, 2015, zaključno poročilo
Zgodovina ogledov
Priljubljeno