Projekti / Programi
Zajem mikrobnih encimov udeleženih v učinkoviti razgradnji kompleksnih rastlinskih polimerov s transkriptomiko in de-novo rekonstrukcijo na nivoju združb
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.03.00 |
Naravoslovje |
Biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B110 |
Biomedicinske vede |
Bioinformatika, medicinska informatika, biomatematika, biometrija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.06 |
Naravoslovne vede |
Biologija |
transkriptomika, de-novo sestava, encimi, razgradnja rastlinskih polimerov, mikrobne združbe, industrijska raba
Raziskovalci (5)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacijŠtev. publikacij |
| 1. |
24975 |
dr. Damjan Makuc |
Kemija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
131 |
| 2. |
20183 |
dr. Boštjan Murovec |
Sistemi in kibernetika |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
208 |
| 3. |
10082 |
dr. Janez Plavec |
Kemija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
1.255 |
| 4. |
27547 |
dr. Zala Prevoršek |
Živalska produkcija in predelava |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
42 |
| 5. |
19104 |
dr. Blaž Stres |
Živalska produkcija in predelava |
Vodja |
2014 - 2017 |
374 |
Organizacije (3)
Povzetek
Rastlinski material bogat s kompleksnimi polisaharidi je pomemben sestavni del prehrane rastlinojedih in vsejedih sesalcev. Sesalci s svojimi prebavnimi encimi polisaharidov rastlinske celične stene ne morejo razgraditi, zato njihovo hidrolizo zagotavlja mikrobna združba v njihovih prebavilih. Razmere v prebavilih omogočajo razvoj mikrobne združbe z zelo velikim številom celic, v kateri popolnoma prevladujejo striktno in obvezno anaerobni mikroorganizmi. Glavni produkti anaerobne fermentacije so kratkoverižne maščobne kisline, ki prispevajo tudi do 70 % potrebne energije za rast in razvoj v primeru večjih prežvekovalcev. Mikrobna razgradnja v prebavilih rastlinojedih sesalcev, predvsem v vampu prežvekovalcev, poteka veliko hitreje kot drugje, kar kaže, da ima prebavna mikrobiota izjemno kapaciteto za hitro in uspešno razgradnjo lignoceluloznega substrata. Posledično je tudi zanimanje za industrijsko izkoriščanje encimov, kI so udeleženi pri pretvorbi rastlinskih polisaharidov, izjemno. AgResearch, Nova Zelandija, (www.globalrumencensus.org.nz) je v okviru mednarodnega projekta “Global Census of Rumen Microbial Diversity Project” zbral vzorce vsebine vampov prežvekovalcev z različnih lokacij po svetu, vrst, reje, spola in prehrane, kjer vzorci divjih prežvekovalcev, kamel in makropodov predstavljajo poseben primer mikrobnega ekosistema z največjo učinkovitostjo razgradnje rastlinskega materiala. Iz bioinformatskih analiz podatkov globokega sekvenciranje filogenetdkih markerjev bakterij, arhej, protozojev, gliv ter izbranih funkcionalnih genov bomo lahko ugotovili filogenetsko sestavo jedrne mikrobne združbe na opisanih nivojih, opredelili raznolikost posameznih mikrobnih skupin ter njihovo odvisnost pojavljanja od vrste, prehrane, reje, izkoristkov prehrane in drugih izmerjenih parametrov. V nadaljevanju nameravamo z globokim sekvenciranjem transkriptoma določiti obseg in vrste mikrobnih transkriptov z rekonstrukcijo neodvisno od podatkovnih baz. To bo služilo kot osnova za identifikacijo transkriptov funkcionalnih genov, ki v prebavilih sesalcev sodelujejo v razgradnji polisaharidov rastlinskih celičnih sten, njihove narave in dinamike izražanja ključnih genov za razgradnjo kompleksnih polisaharidov. Kot osnova bodo služili vzorci prebavil divjih prežvekovalcev z visoko učinkovitostjo razgradnje rastlinskih polimerov.
Po opravljenih analitiskih primerjavah med pridobljenimi seti podatkov, njihovem sestavljanju v časovne rezine in sočasnega pojavljanja z metaboliti, po primerjavah z že znanimi sekvencami različnih encimov bomo lahko identificirali še neznana encimska zaporedja, ki se bodo izražala vzporedno z znanimi, jih subklonirali in pripravili za direktno ekspresijo v od gostitelja neodvisnih ekspresijskih sistemih in po preverjanju njihovih specifiččnih aktivnosti ta zaporedja izrazili tudi v živih gostiteljih (E.coli, Prevotella ruminicola, Bacteroides sp)
Pomen za razvoj znanosti
Rezultati raziskave so prispevali k razumevanju, kako število različnih transkriptov polisaharidnih genov mikrobnih združb in njihova relativna porazdelitev ter časovna dinamika izražanja odraža potencial za mikrobno razgradnjo kompleksnih rastlinskih polimerov naravnega izvora, saj je za uspešno razgradnjo polimernih snovi pomembno vse troje: prisotnost, relativna zastopanost in dinamika spreminjanja. Zaradi direktnega sekvenciranja in denovo rekonstrukcije transkriptov je bila analiza neodvisna od podatkovnih baz, ki vsebujejo v dobršni meri le podatke gojenih predstavnikov, s čimer smo na tak način prvič fizično mapirali ekspresije posameznih genov v operone, kar kaže pomen njihovega sočasnega koncertiranega izražanja, kar je povsem nov vidik, ki je pomemben za razumevanje delovanja mikrobnih sistemov, za razumevanje mikrobne ekologije prebavil, povečanje produktivnosti metabolnih procesov, ter zajemanje nastalih razkrojnih produktov v druge industrijske procese, ter izrabo encimov v industrijski razgradnji rastlinskih polimerov (npr. lesna industrija v povezavi z industrijo papirja in čistilnih sredstev, bioplin, industrijske fermentacije, biogoriva). Nenazadnje, tako detaljno mapiranje transkriptov mikrobnega sistema prebavnega trakta je zaradi velike količine podatkov omogočilo povezovanje ugotovitev z drugimi mikrobnimi sistemi, kjer podobnih študij še niso opravili, obstajajo pa parcialni podatki, kjer so nedavne molekularne študije pokazale prisotnost sorodnih mikroorganizmov ali posameznih encimov ali njihovih parcialnih transkriptov, kot je razgradnja ostankov iz proizvodnje papirja. Zaradi nabora velike količine simetrično strukturiranih podatkov in faktorialne zasnove študije, časovnih rezin ter spremljanja metatranskriptoma glede na metabolom smo pridobili velike količine podatkov, ki zahtevajo daljše obdobje analiz in so tako osnova za pripravo končnih publikacij v znanstvenih publikacijah. Nekatere smo uspeli realizirati, velika večina je v pripravi. Iz projekta sta izšli tudi dve patentni prijavi prijavljeni na UK-IPO, dva prototipa merilne tehnike s pripadajočo programsko opremo in krmiljenjem motorjev, izboljšane in standardizirane tehnike analize TSOC, redukcijskih sladkorjev, SCFA ter aromatskih spojin preko spektroskopije, kar je nedvomno zelo dobra popotnica za prihodnje projekte, doktorate, magistrske naloge, ter industrijske naloge. Stranski produkt projekta je poleg naštetih metod zgoraj tudi metodološki razvoj in rutinska uvedba tehnike NMR v tekočem in NMR v trdnem za analize metabonoma anaerobnih procesov na nivoju sistemske biologije anaerobnih okolij: vampi prežvekovalcev, anaerobni reaktorji bioplinskih elektrarn, prebavni trakt človeka, tekočine telesa človeka (urin, kri). Tehniko NMR v tekočem namreč smo uporabili kot hitro pretočno tehniko za spremljanje poteka, mapiranje stanja biokemijskih reakcij brez predhodnih ekstrakcij tarčnih snovi v vseh zgoraj naštetih anaerobnih sistemih kot tudi aerobnih (humana metabolomika). S testiranjem na vzorcih različnih vrst prežvekovalcev smo tudi razvili analitsko platformo za zgodnje diagnosticiranje inhibicije reaktorjev ter odkrivanje simptomov (sub)aktune vampne acidoze pri prežvekovalcih, s čimer smo med prvimi lahko sistematično razširili uporabo tehnike NMR tudi na druge industrijske anaerobne sisteme, kot je produkcija bioplina v bioplinskih elektrarnah, kot tudi veterina in varstvo živalske proizvodnje. S tem je tehnika NMR v tekočem nadomestila bolj zamudno in kompleksno analizo majhnega števila organskih spojin s plinsko kromatografijo, ki poteka preko ekstrakcije organskih snovi v organskih topilih, in se trenutno uporablja kot glavna analitska tehnika na teh področjih. Tehniko NMR smo na koncu uporabili tudi za določanje encimskih reakcij pri razgradnji kompleksnih rastlinskih polimerov s kvasnimi celičnimi tovarnami ali in-vitro eksprimiranimi proteini.
Pomen za razvoj Slovenije
Identifikacija novih posameznih encimov ter identifikacija do sedaj neopisanih encimskih mešanic, ki koncertirano sodelujejo v določenih časovnih intervalih pri razgradnji kompleksnih organskih polimerov, predstavlja pot naprej do priprave industrijskih pripravkov za uporabo v različnih tipih industrije (papirna, detergenti, fermentacije, priprava krme, predelava hrane, bioplin). Iz analiz časovnih rezin in razgradnje rastlinskih substratov smo pridobili nova zaporedja iz mRNA, in za izražene funkcionalne proteinske produkte dokazali njihovo industrijsko vrednost. Pripravo materialov za proizvodnjo tarčnih encimov smo izvedli na nivoju in-vitro sinteze proteinov ter v obliki kvasnih celičnih tovarn in z uporabo 1H-NMR potrdili njihovo aktivnost za razgradnje ligninskih rešetk v realnih lignoceluloznih substratih. Za zaščito intelektualne lastnine in prenosa v proizvodnjo na večji velikostni skali v obstoječa ali novoustanovljena podjetja se nismo še odločili zaradi časovno obsežnega postopka izvedbe teh postopkov na UL, nerazumevanja na matični inštituciji, sistemsko neurejenega postopka prijave in zaščite intelektualne lastnine, oviranja postavitve laboratorije za proizvodnjo teh produktov, zato podatkov zaradi naštetih razlogov varnostno še nismo popolnoma javno sprostili, dokler vsi ti parametri niso urejeni. Uporabni potencial je s tem zaščiten za industrijsko rabo. Kot prvi smo pridobili informacije o genetskem potencialu mikrobnih združb v prebavilih slovenskih avtohtonih vrst divjih prežvekovalcev, ki do sedaj še niso bile opisane, informacije za razgradnjo rastlinskih polimerov, s čimer smo signifikantno razširili poznavanje njihovega ustroja, kot dela naravne dediščine, posebno v primerjavi z že znanimi podatki udomačenih prežvekovalcev, kar je nedvomno dobrodošlo tudi za vse ljubitelje narave in upravljavce gozdov ter lovce. Na osnovi zbranih podatkov smo ustvarili lokalno podatkovno bazo zbranih informacij o metabolomih, metagenomih in metatranskriptomih obravnavanih živalskih vrst, vse v povezavi z NMR analizami rastlinskih substratov in pregledom identificiranih rastlinskih vrst in vrst rastlinskih polimerov v hrani prežvekovalcev, ki že predstavlja izvrstno zbirko podatkov o prebavilih divjih prežvekovalcev slovenskega visokogorja. Pri delu smo tudi izvedli knjižnico genetskih zaporedij predominantnih rastlin na preiskovanem področju ter njihovo identifikacijo ter diverziteto v prebavnih traktih prežvekovalcev. V sklopu projekta sta dva magistrska študenta mikrobiologije uspešno opravila svoje raziskave in magistrirala. Uvedba tehnike NMR v tekočem za rutinsko spremljanje mikrobioloških procesov v anaerobnih sistemih ima sedaj izreden potencial za ustreznejše vodenje anaerobne razgradnje na industrijski skali, zmanjšanju inhibicijskih dogodkov zaradi hitrosti, občutljivosti, ponovljivosti, široke detekcije organskih molekul ter novih statističnih analiz. Zaradi sovpadanja med procesi, ki potekajo v prebavilih, na industrijski skali bioplinskih reaktorjev ter riževih poljih smo dokazali pomen NMR za področja povezana z veterino, prehrano in zdravjem živali (zgodnje odkrivanje pojava subakutne vampne acidoze) ter prehrano ljudi (okolje), s čimer smo razširili industrijsko rabo raziskovalne opreme.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2015,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2015,
zaključno poročilo
