Projekti / Programi
Molekularni mehanizem signalizacije enoverižne DNA preko znotrajceličnega Tollu-podobnega receptorja 9
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.01.00 |
Medicina |
Mikrobiologija in imunologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B500 |
Biomedicinske vede |
Imunologija, serologija, transplantacija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.01 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Temeljna medicina |
Tollu podoben receptor TLR9, enoverižna DNA z nemetiliranim CpG motivom, prirojena imunost, proteolitska cepitev, oligonukleotidi s CpG motivom
Raziskovalci (13)
| št. |
Evidenčna št. |
Ime in priimek |
Razisk. področje |
Vloga |
Obdobje |
Štev. publikacij |
| 1. |
14360 |
dr. Mojca Benčina |
Biotehnologija |
Vodja |
2014 - 2017 |
375 |
| 2. |
35277 |
dr. Tina Fink |
Biokemija in molekularna biologija |
Tehnični sodelavec |
2017 |
22 |
| 3. |
34529 |
dr. Vida Forstnerič |
Biotehnologija |
Mladi raziskovalec |
2014 - 2015 |
40 |
| 4. |
17915 |
dr. Helena Gradišar |
Biotehnologija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
125 |
| 5. |
23563 |
dr. Iva Hafner Bratkovič |
Nevrobiologija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
194 |
| 6. |
10412 |
dr. Simon Horvat |
Biotehnika |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
526 |
| 7. |
06628 |
dr. Roman Jerala |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
1.129 |
| 8. |
34069 |
dr. Duško Lainšček |
Biotehnologija |
Mladi raziskovalec |
2014 - 2015 |
116 |
| 9. |
34252 |
dr. Tina Lebar |
Biokemija in molekularna biologija |
Tehnični sodelavec |
2015 - 2017 |
66 |
| 10. |
32984 |
dr. Jan Lonzarić |
Biokemija in molekularna biologija |
Tehnični sodelavec |
2014 - 2016 |
46 |
| 11. |
17917 |
dr. Andreja Majerle |
Biotehnologija |
Raziskovalec |
2014 - 2017 |
92 |
| 12. |
29991 |
Alja Oblak |
Biokemija in molekularna biologija |
Raziskovalec |
2014 |
60 |
| 13. |
32113 |
dr. Jelka Pohar |
Biotehnologija |
Raziskovalec |
2015 - 2017 |
87 |
Organizacije (2)
Povzetek
Naravni imunski odziv predstavlja prvo obrambno linijo telesa pred okužbami s patogeni. Prepoznavanje molekulskih vzorcev patogenov, PAMPov, poteka preko družine Tollu podobnih receptorjev, TLR, ki sodelujejo v zgodnji fazi imunskega odgovora. Aktivacija prirojenega imunskega odgovora sproži sintezo vnetnih posrednikov, citokinov, ki posledično aktivirajo pridobljeni imunski odziv. Pretiran in nenadzorovan imunski odziv lahko pripelje do akutnega vnetja, kot sta sepsa in septični šok. Prav tako, endogeni, gostitelju lastni ligandi, DAMPi, vključno z nukleinskimi kislinami, ki se sprostijo ob sterilnem vnetju in poškodbah tkiva, lahko aktivirajo receptorje TLR in prispevajo k razvoju avtoimunih bolezni: sistemski lupus eratimetozus, vnetje črevesja, psorioaza, multipla skleroza, revmatoidni artritis in ateroskleoroza.
Molekularni mehanizmi prepoznavanja enoverižne DNA, ssDNA, z receptorjem TLR9 in fiziološka vloga proteolizne cepitve na aktivacijo receptorja in prirojene imunosti so slabo poznani. Receptor TLR9 prepoznava nemetilirano ssDNA, ki je značilna za bakterije in viruse. Sintetični oligonukleotidi z motivom CpG, CpG-ODNi, posnemajo aktivacijo TLR9 z mikrobno DNA. Točkovne mutacije tako na N- kot tudi na C-koncu ektodomene TLR9 inhibirajo aktivacijo receptorja. Kompleks TLR9 s CpG-ODNi se zadržuje v endosomih, katerih zakisanje je ključno za signalizacijo. Inhibicija endolizosomalne proteolize inhibira aktivacijo receptorja TLR9 z ODNi in prepreči proteolizno cepitev ektodomene mišjega TLR9. Prikazana vloga N-končnih aminokislinskih ostankov ektodomene za vezavo in aktivacijo TLR9 ne podpira predpostavljenega mehanizma, da je proteolizno cepljen receptor TLR9 ključen za aktivacijo receptorja.
Predlagamo model aktivacije TLR9, kjer je potrebnih več vezavnih mest v ektodomeni TLR9 za prepoznavanje CpG-ODNov in aktivacijo receptorja, medtem ko je proteoliza potrebna za razgradnjo proteinov, ki vežejo DNA v endosomih in sprostitev DNA za vezavo DNA na TLR9. Verjetno je, da proteolitska cepitev receptorja TLR9 ni nujno potrebna za samo aktivacijo TLR9.
Nameravamo ugotoviti mehanizem prepoznavanja ssDNA z znotrajceličnim receptorjem TLR9 in določiti biokemijske osnove za razlikovanje agonistov in antagonistov TLR9. Hipotezo bomo preverili z ugotavljanjem učinka racionalno izbranih točkovnih mutacij v ektodomeni TLR9 na aktivacijo receptorja v človeških celicah in z merjenjem neposredne vezave liganda z receptorjem. Nameravamo ugotoviti izvor vrstno specifičnega razlikovanja aktivacije TLR9 s pripravo in analizo himernih receptorjev med človeškim in mišjim TLR9. Naši rezultati demonstrirajo, da skrajšan mišji TLR9 skoraj popolnoma in skrajšan človeški TLR9 popolnoma inhibira aktivacijo, kar potrjuje obstoj drugega vezavnega mesta na N-koncu ektodomene TLR9. Hipotezo o vlogi endosomalne proteolize pri aktivaciji receptorja TLR9 nameravamo preveriti z rekonstitucijo in vitro endosomalnih interakcij med TLR9, ODNi, DNA-vezavnimi proteini, proteazami in njihovimi inhibitorji. Pri tem bomo merili neposredno interakcijo med ODNi in TLR9 z metodo AlphaScreen. Za potrditev hipoteze bomo preverili učinek DNA-vezavnih proteinov sestavljenih iz D-aminokislin, ki so odporni na proteolizo. Načrtujemo izvesti študijo QSAR sintetičnih ODN-ov glede na njihovo sposobnost stimulacije TLR9, kar bo prav tako prispevalo k razumevanju strukturnih mehanizmov aktivacije TLR9 in omogočilo sintezo oligonukleotidov z izboljšanim terapevtskim potencialom, ki jih bomo lahko uporabili kot adjuvanse in kot zdravila, za terapevtsko intervencijo za zdravljenje imunsko pogojenih vnetnih obolenj, kot so revmatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus in luskavico.
Pomen za razvoj znanosti
Pod okriljem raziskovalnega projekta smo se posvetili študiji molekularnega mehanizma prepoznavanja ligandov z receptorjem TLR9 s ciljem razvoja novih agonistov in antagonistov. Pomanjkljiv odziv celic na bakterijsko ali virusno okužbo ima lahko resne posledice za zdravje ljudi. Nasprotno pa lahko pretiran imunski odziv sproži nastanek avtoimunih obolenj ter kronična in akutna vnetja. Razvidno je, da je razumevanje aktivacije receptorjev TLR eden od osnovnih, aktualnih problemov imunologije in medicine. Znanje o mehanizmu prepoznavanja molekulskih vzorcev je nujno za razumevanje fizioloških procesov v celicah in organizmih, pa tudi predpogoj za racionalno načrtovanje zdravil. Pokazali smo, da je nukleotidno zaporedje agonistov TLR9 ključno za učinkovito aktivacijo receptorja. Prisotnost kratkih razgradnih produktov DNA močno izboljša aktivacijo receptorja TLR9 z agonisti. Pojasnili smo mehanizme prepoznavanja nemetilirane enoverižne DNA s TLR9, kar bo omogočilo razumevanje obrambnih mehanizmov pred bakterijskimi in virusnimi okužbami. Opisan mehanizem aktivacije TLR9 služi kot platforma za racionalno pripravo terapevtsko pomembnih agonistov in antagonistov. Rezultati projekta vodijo k novim znanstvenim spoznanjem o delovanju prirojenega imunskega odziva in so zanimiva za širšo znanstveno javnost. Rezultati projekta predstavljajo tudi pomemben korak pri razvoju novih eksperimentalnih metod za analizo vezave ligand-receptor.
Pomen za razvoj Slovenije
V preteklem obdobju so člani projektne skupine preko izjemnih uspehov na tekmovanjih raziskovalnih projektov s področja sintezne biologije v najbolj eminentni svetovni akademski konkurenci pomembno pripomogli k promociji naravoslovja in znanosti v širši javnosti in k promociji Slovenije kot države z dobro znanostjo in izobraževanjem. Omenjeni uspehi so odmevali po vsem svetu z objavami v časopisih, revijah, dnevnikih, na radiu, TV in spletnih straneh. V okviru projekta smo poglobili obstoječe sodelovanje z raziskovalnimi skupinami doma in iz tujine in izkoristili mednarodne povezave na način izmenjave znanja in z delovnimi obiski raziskovalcev. S tem smo zagotovili povečano mobilnost v raziskovalni sferi in pretok znanja. Spodbujali smo izmenjavo podiplomskih študentov in raziskovalcev v obliki delovnih obiskov. V projekt smo vključili mlade raziskovalce in dodiplomske študente in s tem prispevati k večjemu številu visoko izobraženega kadra s celovitim znanjem na področju naravoslovja. Izkušenejši raziskovalci smo se vključili kot mentorji mlajšim kolegom in dodiplomskim študentom. Sodelujoči raziskovalci smo dobili s projektom odlično platformo za izvajanje vrhunskih raziskav, izmenjavo izkušenj in znanja. Z objavami rezultatov v mednarodno uveljavljenih najboljših znanstvenih revijah in s konferenčnimi predstavitvami ter seminarji smo širili in seznanjali stroko z novimi inovativnimi tehnologijami in dosežki projekta, kar je pomembno za prepoznavnost raziskovalne skupine in znanosti v državi.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Letno poročilo
2014,
2015,
zaključno poročilo
