Projekti / Programi
Razvoj novih celičnih linij človeških jeter za raziskave genotoksičnosti in karcinogenosti: novo upanje za človekovo zdravje in zaščito laboratorijskih živali
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 1.03.00 |
Naravoslovje |
Biologija |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B200 |
Biomedicinske vede |
Citologija, onkologija, kancerologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.06 |
Naravoslovne vede |
Biologija |
genotoksičnost, metabolična transformacija, in vitro testiranje, človeške jetrne celice, matične celice, toksikogenomika, laboratorijske živali
Raziskovalci (14)
Organizacije (2)
Povzetek
Trenutno veljavna zakonodaja zahteva testiranje genotoksičnosti za vse novo razvite kemikalije in produkte kot so zdravila, kozmetika, zdravila, kozmetični pripravki, prehranski in krmni dodatki, pesticidi ipd. Smernice, ki urejajo testiranje genotoksičnosti predvidevajo, da se to začne s setom in vitro testiranj na bakterijah in sesalčjih celicah, čemur v primeru pozitivnih rezultatov nujno sledijo še poskusi na glodavcih. V skladu s predlagano strategijo Referenčnega laboratorija Evropske unije za alternative poskusom na živalih (EURL ECVAM) je "Preprečevanje in zmanjševanje uporabe živali v genotoksikologiji" mogoče doseči z razvojem bolj zanesljivih in vitro testov, ki bi jim sledilo manj in vivo preverjanj, kar je namen predlaganega projekta. Ocenjuje se namreč, da je trenutno 80% vseh izvedenih in vivo testiranj genotoksičnosti v EU posledica lažnih pozitivnih rezultatov in vitro testiranj, in bi se jim lahko izognili z bolj zanesljivimi testi. Pomemben razlog za lažne pozitivne rezultate v obstoječih in vitro testih je ta, da sesalčje celične linije, ki so na voljo, ne izražajo vseh metabolnih encimov I. in II. stopnje, ki v živih organizmih katalizirajo metabolno aktivacijo in detoksifikacijo genotoksinov. Namen opisanega projekta je razvoj humanih jetrnih celic, v katerih bodo aktivni encimi I. in II. faze metabolizma, ki bodo v primerjavi z znanimi celičnimi linijami bolje odražale biotransformacijo in genotoksično delovanje kemikalij v organizmu. Za nekatere celične linije človeškega izvora je bilo v preteklosti že pokazano, da se je v njih ohranila aktivnost nekaterih encimov, ki sodelujejo pri presnovi zdravil, a zaradi nestabilnosti in manjkajočih pomembnih encimov niso primerne rutinske teste. V okviru predlaganega projekta bomo opravili primarni presejalni preizkus nabora obstoječih jetrnih celičnih linij, ki izvirajo iz celic človeškega hepatoma, iz matičnih celic ali iz imortaliziranih primarnih jetrnih celic. Na ta način bomo prepoznali najobetavnejše celične linije, ki izražajo metabolne encime I. in II. stopnje in omogočajo zaznavo genotoksičnih učinkov znanih genotoksičnih rakotvornih snovi različnih skupin. V izbranih celičnih linijah bomo preučili transkripcijo jetrno specifičnih transkripcijskih faktorjev (LETF), ki regulirajo transkripcijo encimov za metabolizem kemikalij, njihovo aktivnost in izražanje proteinov ter jih primerjali s primarnimi človeškimi hepatocitami. V nadaljevanju bomo izboljšali občutljivost izbranih celic za zaznavanje genotoksičnih učinkov kemikalij z uporabo novega pristopa, ki temelji na ponovni aktivaciji izražanja ključnih encimov za metabolizem kemikalij s transfekcijo ekspresijskih vektorjev z geni za ključne LETF, ki regulirajo njihovo izražanje. V zadnji fazi projekta bomo za najprimernejšo novo celično linijo izdelali protokol za test mikrojeder. Protokol bomo validirali preko testiranj kemikalij s seznama, ki ga je v ta namen sestavila skupina strokovnjakov v ECVAM, ki se ukvarja z z validacijo novih in vitro testov genotoksičnosti. Pričakujemo, da bo z novo celično linijo moč doseči zanesljivejše (tj. manj lažnih pozitivnih) rezultate testov genotoksičnosti. S tem bomo pomembno prispevali k zmanjšanju potreb po uporabi glodavcev v rutinskih testiranjih genotoksičnosti in k povečanju zanesljivosti ocen tveganja pri razvoju novih kemikalij in produktov, kar je ključno za varovanje zdravja ljudi.
Poleg tega bo nova celična linija koristna za študije akutne toksičnosti ter za farmakološke raziskave metabolizma zdravil. Inovativen in ambiciozen projekt bo realiziran v okviru sodelovanja Slovenskih znanstvenikov z Nacionalnega inštituta za biologijo in Onkološkega inštituta Ljubljana z Avstrijskimi znanstveniki z Medicinske univerze na Dunaju saj se njihovo strokovno znanje in izkušnje s področja genetske toksikologije, molekularne biologije, biologije matičnih celic naprednih »omskih« tehnologij dopolnjujejo.
Pomen za razvoj znanosti
V 21. stoletju poteka hiter proces prehoda od in vivo testov na živalih k in vitro metodam. Vendar pa imajo modelne celice, ki so trenutno na voljo za in vitro toksikološke raziskave nasplošno kot tudi za testiranje genotoksičnosti, številne omejitve, pri čemer so najpomembnejše vezane na nizko zastopanost encimov presnove ksenobiotikov. Posledica tega so nezanesljivi rezultati samih testiranj, kot tudi neustreznost takšnih modelov za raziskave mehanizmov delovanja toksičnih kemikalij. Potrebo po premostitvi tega problema poudarjajo številni znanstveniki, kar je bil tudi namen tega projekta. Med številnimi celičnimi linijami človeških jeter, ki pa so vse rakavega izvora, smo identificirali dve z najbolj obetavnimi lastnosti: HepG2 celice, ki se že uporabljajo v genetski toksikologiji, in HuH6 celično linijo, ki se do sedaj v ta namen ni uporabljala. S primerjalnimi toksikogenomskimi analizami izražanja ključnih genov, vpletenih v procese presnove telesu tujih snovi (encimi I in II faze presnove, transporterji in jetrno specifični transkripcijski faktorji), smo ugotovili pomembne razlike med HepG2 in HuH6 celicami ter primarnimi človeškimi hepatociti. Ta nova spoznanja so dragocena podlaga za nadaljnje raziskave ključnih dejavnikov, ki uravnavajo aktivacijo presnovnih encimov v in vitro pogojih. Na eni strani je to pomembno za nadaljnji razvoj izboljšanih testnih modelov, na drugi strani pa na osnovi poznavanja mehanizmov delovanja genotoksičnih snovi in hkratnim poznavanjem pomanjkljivosti testnih celic omogoča oceno relevantnosti dobljenih rezultatov za in vivo situacijo. Pomemben znanstveni dosežek projekta je razvoj jetrnim celicam podobnih celic, ki smo jih razvili s transformacijo mezenhimskih matičnih celic, katere smo imortalizirali in dobili stabilno celično linijo. Pokazali smo, da je takšna transfomacija in imortalizacija možna. Nova metabolno aktivna celična linija ima potencial za mnoge aplikacije, ne le v rutinskem testiranju toksičnosti in genotoksičnosti, pač pa tudi v študijah biokemijskih mehanizmov toksičnosti. V primerjavi z drugimi metabolno aktivnimi celičnimi linijami, ki so vse rakavega izvora, je prednost te linije, da celice nimajo lastnosti rakavih celic. Pri rakavih celicah se celični procesi, vključno z odzivi na kemikalije, močno razlikujejo od procesov v normalnih celicah, kar je tudi lahko eden od razlogov nezanesljivosti trenutno uporabljanjih in vitro testnih sistemov. Rezultati raziskav tega projekta doprinašajo nova spoznanja, pomembna tudi na področjih razvoja 3D eksperimentalnih modelov v toksikologiji, ki so trenutno eno najprominentnejših področij raziskav in razvoja in vitro testnih sistemov, v katere smo se tudi mi že aktivno vključili.
Pomen za razvoj Slovenije
Kot je že opisano v utemeljitvi tega projekta, je visoka stopnja lažno pozitivnih rezultatov ena od glavnih težav trenutne zakonodajne ureditve strategije testiranja genotoksičnosti. To vodi k večjemu številu izvedenih in vivo poskusov, ki so potrebni za potrjevanje in vitro rezultatov. To je povezano ne le z vprašanjem etičnosti nepotrebne uporabe ogromnega števila poskusnih živali, temveč tudi z visokimi neposrednimi stroški dodatnega testiranja in posrednimi stroški odloženega trženja proizvodov. Ti problemi so zelo očitni v farmacevtski in kozmetični industriji. V kozmetični industriji je potrebno kemikalije, ki so pozitivne pri in vitro testiranju genotoksičnosti, za razvoj kozmetičnih izdelkov takoj opustiti, saj in vivo testiranje kozmetičnih proizvodov, v skladu s 7. amandmajem k Direktivi o kozmetičnih izdelkih v EU, ni dovoljeno (http://ec.europa.eu/consumers/sectors/cosmetics/files/doc/200315/200315_en.pdf) in ni možno izključiti morebitnih lažno pozitivnih rezultatov. V tem projektu smo identificirali dve celični liniji ter razvili eno celično linijo hepatocitom podobnih celic z obetavnimi lastnostmi za uporabo v genetski toksikologiji. Rezultati kažejo natančnejše napovedi genotoksičnosti, kot trenutno razpoložljivi testi, kar bo v veliki meri prispevalo k zmanjšanju stroškov pri razvoju raznovrstnih izdelkov. Razvoj testa na osnovi takšnih celic bo doprinesel k proizvodnji varnejših in cenejših zdravil ter drugih proizvodov, ki pa bodo na razpolago veliko hitreje. To je z vidika splošnega zdravja ključnega pomena. Kar zadeva družbo, bo zmanjšana uporaba testnih živali pripomogla k zmanjšanju problemov povezanih z vprašanji etičnosti uporabe poskusnih za kar se borijo številne organizacije za pravice živali. Nova celična linija ima tudi potencial za razvoj nove visoko zmogljive avtomatizirane metodologije testiranja genotoksičnosti, ki temelji na uporabi reporterskih markerjev genotoksičnega učinka. Takšna metodologija je trenutno zelo zaželena, še posebej v farmacevtski industriji v zgodnji fazi razvoja zdravil. Povpraševanje po hitrih in natančnih napovednih testih genotoksičnosti je na mednarodnem trgu večje od ponudbe, zato lahko rezultati tega projekta pomenijo neposredno podjetniško priložnost za ustanovitev konkurenčnega spinout podjetja, kar bo pomembno doprineslo k razvoju tako NIBa kot Slovenskega malega gospodarstva. Podjetniško priložnost predstavlja tudi možnost uporabe nove celične linije za komercialno in vitro proizvodnjo človeških metabolnih encimov, ki za rutinsko testiranje genotoksičnosti trenutno niso na voljo. Če povzamemo, bo realizacija našega projekta prispevala k zmanjšanju števila poskusnih živali v genetski toksikologiji ter k večji učinkovitosti in natančnosti toksikoloških študij, kar bo znatno doprineslo k zmanjšanju stroškov razvoja novih proizvodov, varovanju zdravja ljudi ter podjetniški priložnosti, ki lahko pritegne tuje vlagatelje (predvsem farmacevtsko in kozmetično industrija).
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Letno poročilo
2014,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Zaključno poročilo
