Projekti / Programi
Odkrivanje novih regulatorjev izražanja RANKL, ključne molekule ne samo v kostni prenovi
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 3.07.00 |
Medicina |
Metabolne in hormonske motnje |
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B580 |
Biomedicinske vede |
Okostje, mišice, revmatologija, lokomocija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 3.02 |
Medicinske in zdravstvene vede |
Klinična medicina |
Osteoprotegerin, pljučni rak, hondrocit, osteoartroza, osteoblast, osteoporoza, celični model, kloniranje, funkcijska genomika, bioinformatika
Raziskovalci (13)
Organizacije (3)
Povzetek
Ligand za receptor aktivatorja jedrnega dejavnika-κB (RANKL) je del sistema RANKL/RANK/ OPG, ki igra ključno vlogo v kostni resorpciji in več drugih fizioloških procesih. Porušeno uravnavanje RANKL je vpleteno v razvoj osteoporoze (OP), osteoartroze (OA), avtoimunskih bolezni, kroničnih vnetnih bolezni in različnih vrst raka, kar je vodilo do uvedbe denosumaba, monoklonskega protitelesa proti RANKL, v klinično prakso za zdravljenje OP in preprečevanje kostnih zapletov pri bolnikih z metastazami. Medtem, ko je razumevanje posledic aktivacije RANKL razmeroma dobro poznano, pa je presenetljivo malo znanega o stimulusih in molekularnih poteh, ki uravnavajo izražanje samega RANKL. Večina informacij o transkripcijskem uravnavanju izražanja RANKL izhaja iz študij mišjih osteoblastnih/stromalnih celic, medtem ko so podatki o uravnavanju RANKL v človeških celicah izjemno skopi. Dosedanje študije tako kažejo na pomen distalnih ojačevalcev in proksimalnega promotorja, ki lahko sodelujeta preko nepoznanih mehanizmov. Rezultatov študij uravnavanja na mišjih modelih ne moremo neposredno prenesti na človeka, saj se regulatorni elementi razlikujejo med vrstami, prav tako pa lahko tudi med različnimi tipi celic, kar kaže na nujnost nadaljnjih študij uravnavanja gena za človeški RANKL v različnih tipih celic. RANKL nedvomno igra pomembno vlogo pri pogostih degenerativnih boleznih kosti in sklepov kot sta OP in OA, ter tudi pri pljučnem raku, ki predstavlja vodilni vzrok smrti zaradi rakavih obolenj. Kljub temu je transkripcijsko uravnavanje RANKL v humanih osteoblastih, hondrocitih ali rakavih celic pljuč slabo, oziroma sploh še neproučeno. Glavni cilj projekta IREGULAR – Identifikacija novih regulatorjev RANKL, je zato identifikacija transkripcijskih regulatorjev izražanja RANKL v območju proksimalnega promotorja v humanih osteoblastih, hondrocitih in rakavih celicah pljuč. Nadalje želimo ovrednotiti interakcije identificiranih transkripcijskih dejavnikov (TF) z enoverižno DNA, z namenom razumevanja dinamike vezavnega procesa DNA-TF.
Za dosego teh ciljev bomo oblikovali 4 poročevalske plazmide z različno dolgimi odseki promotorja RANKL, ki bodo pokrili območje 900 bp od mesta začetka transkripcije. Vpliv vsakega plazmida na transkripcijo RANKL v človeških hondrocitih, celičnih linijah nedrobnoceličnega raka pljuč z različnim metastatskim potencialom in različno diferenciranih osteoblastnih linijah, bomo vrednotili z merjenjem luciferazne aktivnosti. S pomočjo bioinformatike in mestno specifične mutageneze bomo določili natančna vezavna mesta TF, dejansko vezavo specifičnih TF pa potrdili s testom zamika elektroforezne mobilnosti. Rezultate in vitro dela bomo v nadaljevanju nadgradili z merjenjem TF v humanih kostnih vzorcih bolnikov z OP ali OA oziroma zdravih kontrol z imunohistokemijo in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. Dodatno bomo z uporabo nuklearne magnetne resonance (NMR) in ostalih komplementarnih spektroskopskih metod pridobili informacije o potencialnih sekundarnih strukturah promotorja RANKL in vpogled v interakcije DNA-TF na molekularnem nivoju.
Identifikacija novih TF, vključenih v uravnavanje transkripcije RANKL, bo pomembno pripomogla k razumevanju poti, ki vodijo v porušeno uravnavanje RANKL pri različnih boleznih kot so OP, OA in pljučni rak. Ti TF in njim nadrejeni dejavniki predstavljajo potencialne biološke označevalce aktivnosti RANKL in/ali učinkovitosti zdravljenja z denosumabom ter nove tarče zdravil. Pojasnitev celično specifičnega uravnavanja izražanja RANKL bo lahko prispevala k bolj usmerjenim načinom zdravljenja z zmanjšanimi neželenimi učinki v netarčnih tkivih. Rezultati spektroskopskih študij pa bodo lahko prispevali k razvoju aptamernih zdravil oziroma diagnostikov.
Pomen za razvoj znanosti
Pomen RANKL pri človeku je sicer dobro poznan, malo pa je znanega o načinih uravnavanja njegovega izražanja. Le-to pa je zelo pomembno zaradi vpletenosti RANKL v številne fiziološke procese, kot je kostna prenova, aktivnost limfocitov T in endotelijskih celic itd. Še več, porušeno uravnavanje RANKL je dokazano vpleteno v razvoj osteoporoze, osteoartroze, avtoimunskih bolezni, kroničnih vnetnih bolezni in različnih vrst raka. Namen projekta IREGULAR je zato odkriti nove transkripcijske dejavnike, ki vplivajo na izražanje RANKL. Njihovo odkritje bo namreč omogočilo boljše razumevanje uravnavanja izražanja RANKL in predstavlja osnovo za nadaljnje študije signalnih poti, ki jih uravnavajo ti transkripcijski dejavniki in so lahko vpletne v razvoj pogostih bolezni, predvsem v starajoči se populaciji, kot so osteoporoza, osteoartroza in najpogostejša vrsta raka - pljučni rak. Ker so lahko regulatorni mehanizmi tkivno specifični, bodo odkritja projekta IREGULAR prispevala k bolj usmerjenim načinom zdravljenja v primerjavi s sistemsko delujočim trenutno dostopnim inhibitorjem RANKL denosumabom.
Pomen za razvoj Slovenije
Novi transkripcijski dejavniki, za katere bi v projektu IREGULAR uspeli dokazati vpliv na izražanje RANKL, predstavljajo podlago za razvoj novih zaviralcev RANKL. Medtem ko denosumab, monoklonsko protitelo proti RANKL, zavira učinke RANKL sistemsko, bi s farmakološkim delovanjem na odkrite transkripcijske dejavnike lahko dosegli tkivno specifično uravnavanje (zaviranje) RANKL. Na ta način bi lahko zmanjšali neželene učinke in povečali varnost zdravljenja. Po drugi strani pa bi s študijo o strukturi vezave transkripcijskega dejavnika na DNA projekt IREGULAR podali osnovo za popolnoma nov pristop k zdravljenju osteoporoze, osteoartroze, pljučnega raka ter sekundarne kostne metastatske bolezni z aptameri. Aptameri so visoko specifični in imajo nekatere prednosti pred monoklonskimi protitelesi : za kemijsko sintezo aptamerov ne potrebujemo celičnih kultur; aptameri so bolj stabilne molekule kot protitelesa, zato jih lahko shranjujemo pri običajnih pogojih; in aptameri izkazujejo nizko imunogenost. Nedavno je FDA potrdila prvo »aptamerno osnovano« terapijo pri človeku. Odkritja projekta IREGULAR pa imajo tudi potencialen komercialni pomen v diagnostiki. Na osnovi prisotnosti ali povišanih nivojev transkripcijskega dejavnika in/ali mutacije v proksimalnem promotorju bi lahko napovedali zaplete zaradi pretiranega izražanja RANKL in prepoznavali posameznike, pri katerih bi bila uvedba denosumaba smiselna. Rezultati našega projekta predstavljajo osnovo za razvoj tovrstnega diagnostičnega testa. Tako novi terapevtik kot tudi diagnostik, bi pripomogla k boljši zdravstveni oskrbi predvsem starejših bolnikov z boleznimi kot so osteoporoza, osteoartroza in pljučni rak.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
