Projekti / Programi
Vpogled v interakcije med protein, vpletenimi v odnos krompirja in Virusa krompirja Y
| Koda |
Veda |
Področje |
Podpodročje |
| 7.00.00 |
Interdisciplinarne raziskave |
|
|
| Koda |
Veda |
Področje |
| B230 |
Biomedicinske vede |
Mikrobiologija, bakteriologija, virologija, mikologija |
| Koda |
Veda |
Področje |
| 1.06 |
Naravoslovne vede |
Biologija |
Krompirjev virus Y, PVY- krompir interakcija, protein - protein interakcija, Površinska plazmonska resonanca
Raziskovalci (14)
Organizacije (3)
Povzetek
Krompirjev virus Y (PVY), ki spada v rod Potyvirus, povzroča okužbe krompirja in drugih rastlin iz družine razhudnikovk, v kratkem pa je bil uvrščen med 10 najbolj pomembnih virusov z ekonomskega in znanstvenega stališča. Med ciklom okužbe plaščev protein (CP) in drugi virusni proteini reagirajo med sabo in s proteini gostiteljske rastline, s tem pa je zagotovljeno optimalno razmnoževanje, enkapsidacija in gibanje virusa. Rastlina je prav tako odvisna od teh interakcij, saj so del njenega obrambnega odziva. Obstajajo raziskave, ki opisujejo interakcijo proteinov znotraj sistema Potyvirus-gostitelj, kljub temu je večina gostiteljskih proteinov, ki reagirajo z virusom neznanih. Metoda, ki bi pomagala raziskati nove interakcije proteinov sistema PVY- gostitelj in bi hkrati omogočala raziskave že obstoječih interakcij, bi veliko doprinesla področju. Glavni cilj raziskave je boljše razumevanje interakcij proteinov znotraj sistema PVY-gostitelj. Tekom raziskave bomo z visoko zmogljivo strategijo izbrali tako virusne kot izbrane proteine gostiteljske rastline, jih klonirali in pogledali njihovo izražanje. Izražene proteine bomo očistili, nato pa bomo s pomočjo Površinske plazmonske resonance (SPR) izzvali interakcije med sistemom protein-protein in virusni delci-protein. S pomočjo mutageneze bomo raziskali pomen posebnih aminokislinskih ostankov in/ali proteinskih motivov med interakcijo. Hkrati bomo v rastlinskih ekstraktih različnih kompleksnosti uporabili SPR za iskanje proteinov, ki reagirajo z nemobilnimi PVY delci. Proteini, ki se bodo vezali na delce PVY bomo izprali iz SPR čipa, nato pa jih bomo identificirali z uporabo masne spektrometrije. Poleg tega, se bomo proizvedli PVY virusom podobne delce in optimizirali njihovo sestavljanje. VLP-je bomo očistili, jih uporabili v SPR raziskavah, kjer bodo omogočali ocenitev različnih CP mutacij v interakciji različnih proteinov z VLP. Prav tako bomo poskušali pridobiti 3D strukturo PVY CP, z difrakcijo rentgenskih žarkov in elektronsko mikroskopijo. Pridobljene podatke vključno z novimi interakcijami, dodatno kinetiko in strukturne podatke, bomo vključili v model signalne poti pri obrambi rastlin, ki je trenutno v fazi razširjanja. Če povzamemo, predlagana raziskava bo močno prispevala k boljšemu razumevanju proteinskih interakcij, ki potekajo med okužbo PVY, razkrila bo mehanizme delovanja tega pomembnega virusa in omogočila nove strategije varstva rastlin pred virusom. Poleg tega, bo ta raziskava doprinesla področju nova raziskovalna orodja, kot so SPR za merjenje interakcij virus-gostitelj in PVY VLP, ki predstavljajo obetajoče orodje, ki bi ga lahko uporabili za druge biotehnološke panoge kot so epitopski nosilci ali pa prezentacije v imunske namene. Strokovno znanje o interakcijah med PVY in rastlino, molekularnih interakcijah in strukturi proteinov, ki ga imajo Nacionalni inštitut za biologijo, Kemijski inštitut in Inštitut Jožef Stefan, zagotavlja uspeh predlaganega dela.
Pomen za razvoj znanosti
Rezultati in orodja, pridobljeni v projektu, bodo močno vplivali na področje interakcij med rastlinami in PVY in bodo ekstrapolirani na področje interakcij virus-gostitelj na splošno. Strategija SPR, ki bo testirana s pričujočim predlogom, je nova na tem področju in ne obeta zgolj dopolnitve temveč tudi izboljšanje obstoječih pristopov, kot so dvohibrid kvasovke, ko-imuno precipitacija ali bimolekularna komplementacija. SPR bo ponujal možnost iskanja novih interakcij, potrditev domnevnih in ohranjanje kinetičnih parametrov teh interakcij. Odkritje novih kandidatnih proteinov za interakcije znotraj sistema krompirja in PVY bo doprinesel k izboljšanju razumevanja virusnega biološkega cikla v rastlini, vključujoč vdor, gibanje in odziv obrambnih mehanizmov rastline. Poleg tega bo z izdelavo PVY-VLP produkcijskega sistema omogočeno hitro odkrivanje vplivov mutacij v CP na interakcijo PVY delcev z izbranimi vezavnimi proteini. Hkrati lahko brez-nukleinskih kislin filametnozni PVY-VLP predstavljajo zanimivo izhodišče, ki bi ga lahko z ustreznimi modifikacijami uporabili kot nano biotehnološka orodja, kot so npr. cepiva, nanocevke ali nanodelci v vlogi nosilca. Za PVY proteine ni na voljo nobenih 3D struktur. Rešitev 3D strukture proteinskega plašča, VLP-jev, ali katerega drugega proteina pri PVY infekciji, bo močno vplivalo na razumevanje funkcije tega pomembnega proteina pri virusni infekciji. Hkrati bo omogočal odkrivanje ali potrditev motivov ali domnev, ki so vključena v teh funkcijah (t. j. motivi interakcij proteinov). Vsi dobljeni podatki bodo tudi služili povečanju že sedaj rastočega modela signalnih poti obrambe rastline in bo omogočal pridobivanje novega znanja o krompirju v povezavi z interakcijo s PVY.
Pomen za razvoj Slovenije
Rezultati predlaganega projekta so nanašajo na področja biotehnologije in sistemske biologije, za zdravje in varno hrano in tako ustrezajo največjim slovenskim in prioritetam Evropske Unije. Novo znanje o biologiji najbolj pomembnega virusa, ki povzroča okužbe krompirja (PVY) ima neposreden vpliv na kmetijsko produkcijo in posledično na gospodarstvo države. Boljše razumevanje interakcij med virusi in rastlinami lahko omogoča sprejemanje novih strategij nadziranja virusa, ki bodo koristna za kmete, rejce in kmetijstvo na splošno. Pri projektu bomo za čiščenje PVY-VLP prilagodili metodo, ki temelji na CIM monolitični kromatografiji. CIM monolite izdeluje slovensko podjetje BIA separations, s katerim NIB uspešno sodeluje že dolgo časa. Nova uporaba njegovih izdelkov bo še bolj spodbudila že tako uspešno širitev na mednarodni trg, tako kot tudi njegovo delo z državno visokotehnološko industrijo. Poleg tega vsi trije partnerji, NIB, IJS in KI, uspešno sodelujejo s farmacevtskimi podjetji, kot je Lek d.o.o. ali z biotehnološkimi podjetji, kot so že omenjeni BIA separations, Oxford nanopore in drugi. Vsi imajo različne patente bodisi že zagotovljene bodisi so v pripravi. Poleg tega so pripomogli k prodoru podjetij, kot je Biosistematika (partner NIB-a). Vse to omogoča hiter in tekoč prenos osnovnega znanja, ki bi ga pridobili s tem projektom, in bi ga lahko uporabili v industriji, če bi se omogočila primerna priložnost. Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo že več kot 15 let intenzivno sodeluje s predstavniki Ministrstva za kmetijstvo in gozdarstvo, službo za fitosanitarno inšpekcijo in z drugimi strokovnjaki s področja varovanja rastlin. Takim predstavnikom bomo tudi posredovali znanje, ki ga bomo pridobili s tem projektom.
Najpomembnejši znanstveni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
Najpomembnejši družbeno–ekonomsko in kulturno relevantni rezultati
Vmesno poročilo,
zaključno poročilo
