Znano je, da epigenetske spremembe omejujejo funkcionalno sposobnost starih krvotvornih matičnih celic. To je lahko razlog za slabši rezultat terapij, ki temeljijo na presaditvah krvotvornih matičnih in progenitrskih celic. Cilj naše raziskave je bil ugotoviti kakšen epigenetski profil imajo za celice CD34+ obogateni celični pripravki namenjeni avtolognemu zdravljenju bolnikov s kardiomiopatijo. Ugotovili smo, da je globalna metilacija DNA bistveno večja pri CD34+ celičnih pripravkih kot pri produktih levkafereze, ki vsebujejo večinoma levkocite (2,33 ± 1,03% v primerjavi s 1,84 ± 0,86%, p = 0,04). Globalna hidroksimetilacija se ni razlikovala med CD34+ celicami in levkociti (p = 0,30). Z merjenjem metiliranosti 94 transkripcijskih dejavnikov pomembnih za matične celice, smo identificirali 15 dejavnikov, pri katerih je bila povprečna metiliranost promotorja bistveno drugačna med levkociti in CD34+ celicami. Razlika je bila največja pri HOXC12 (58,18 + - 6,47 % v primerjavi s 13,34 + - 24,18 %, p = 0,0009) in NR2F2 (51,65 + -25,89 % v primerjavi s 7,66 + - 21,43 %, p = 0,0045) geni. Naše ugotovitve kažejo, da se globalna metilacija DNA in hidroksimetilacija ter ciljni metilacijski profil izbranih genov v CD34+ celičnih produktih ne razlikuje bistveno od levkafereznih produktov in nam tako pove malo o funkcionalni zmogljivosti in regenerativnih lastnostih CD34+ celic. V prihodnjih študijah je treba preučiti še druge značilnosti CD34+ presadka, in najti tiste, ki bodo lahko služile kot prognostično orodje pri avtologni presaditvi.
COBISS.SI-ID: 33302489
Starostno skrajševanje telomer v matičnih/progenitornih celicah ima lahko za posledico slabšo funkcionalnost celic in zato slabše učinke celičnih terapij. Cilj te študije je bil raziskati učinek dolžine telomer in ekspresije hTERT pri CD34+ obogatenih celicah na klinični izid avtologne transplantacije za zdravljenje srčnega popuščanja. Študija je vključevala 43 bolnikov s kardiomiopatijo. Bolniki so prejemali faktor za mobilizacijo celic CD34+ v periferno kri, celice CD34+ smo iz levkafereznih pripravkov izolirali z imunomagnetno selekcijo ter jih transendokardialno vbrizgali v srce. Relativno dolžino telomer in raven izražanja hTERT smo izmerili z metodo PCR v realnem času. Izolirane celice CD34+ so imele daljše telomere v peimerjavi z levkafereznimi vzorci (p = 0,001). V multivariatni analizi nismo ugotovili povezave med dolžino telomer in kliničnim izzidom zdravljenja (b = 3,306, p = 0,540). Medtem ko je bilo izražanje hTERT v vseh levkafereznih produktih zanemarljivo, je 94,4% CD34+ celičnih produktov izražalo hTERT. Višje izražanje hTERT je bilo povezano z boljšim kliničnim izidom kar smo preverili z univariatno analizo (b = 87,911, p =0,047). Naše ugotovitve kažejo, da dolžina telomer v CD34+ celičnih produktih ne vpliva na klinični izid pri bolnikih s kardiomiopatijo zdravljenih z avtologno presaditvijo celic CD34+. Potrebno pa bi bilo opraviti tudi bolj obsežno študijo za potrditev vpliva izražanja hTERT na klinični izid avtologne transplantacije celic CD34+.
COBISS.SI-ID: 33303001
Ozadje: Klinični protokoli za diferenciacijo monocitov v dendritične celice (DC) zahtevajo uporabo živalskih dodatkov brez seruma. Tudi medij brez seruma lahko zahteva do 1% dodatek seruma. Prav tako pa 3R (Refinement, Reduction, Replacement ) priporočila priporočajo uporabo neživalskih serumov v in vitro študijah. Namen te študije je bil raziskati ali lahko trombocitni lizat (TL) uporabimo za diferenciacijo DC iz monocitov. Metode: Izolacijo smo opravili z imunomagnetno selekcijo iz pripravkov mononuklearnih celic pridobljenih od zdravih darovalcev. DC smo diferencirali v mediju RPMI1640 z 10% fetalnega govejega seruma (FBS), 10% AB seruma ali 10% TL z dodatkom dejavnika za rast granulocitnih in makrofagnih kolonij in interlevkina 4. Diferencirane DC smo okarakterizirali za morfologijo, viabilnost, endocitosko sposobnost, površinski fenotip (nezrele, zrele in tolerogene DC) in aktivacijo pomembnih signalnih poti. Njihovo funkcionalnost smo določali na osnovi alostimulatorne sposobnosti, profila citokinov in sposobnosti za indukcijo različnih populacij celic T pomagalk. Rezultati: DC gojene s TL kažejo normalno morfologijo in viabilnost ter endocitotsko sposobnost. Njihov fenotip je primerljiv z DC gojenimi s FBS. Kazale so funkcionalno plastičnost in povečano izražanje tolerogenih označevalcev kot odziv na okolje. Zrele DC gojene v TL so imele nespremenjen alostimulatorni potencial in sposobnost za indukcijo Th1 odziva. Uporaba TL je omogočila aktivacijo ključnih signalnih proteinov povezanih z diferenciacijo in zorenjem DC. Diskusija: Naša študija je prva, ki kaže da lahko TL kot učinkovito alternativo FBS uporabimo za diferenciacijo DC iz monocitov. Tako pridobljene DC imajo vse lastnosti, ki jih imajo DC pridobljene s klasičnimi protokoli.
COBISS.SI-ID: 33118169
Vsaditev transplantiranih CD34+ celic temelji na kakovosti celičnega pripravka. Trenutno na voljo ni veliko podatkov o daljšem shranjevanju izoliranih CD34+ celic. Cilj naše študije je bil oceniti stabilnost celičnih pripravkov, kjer izolirane CD34+ celice shranjujemo pri visoki koncentraciji (80 × 106 in 6 mL) v majhnih vrečkah namenjenih presaditvi. Celične pripravke smo pripravili z levkaferezo in imunoselekcijo (postopek Clinimacsplus) iz 13 bolnikov s kronično dilatativno kardiomiopatijo. Izolirane CD34+ celice smo shranjevali na 2-8°C ter analizirali ob času 0 (sveži pripravki), 24h, 48h, 4 in 6 dni. S pretočno citometrijo smo določali viabilnost, absolutno število viabilnih CD34+ celic in delež apoptotskih celic. S sistemom BACTEC smo prevejali tudi sterilnost produktov. Povprečna viabilnost celic D34+ se je zmanjšala za 2.7% v prvih 24h urah, za 13.4% v 48h in za 37,5% v 6 dneh. Povprečen izkoristek pri številu živih CD34+ je bil 91,1%, 74,8%, 66,3% in 56,2% po 24 h, 48 h ter 4 in 6 dneh. Delež apoptotičnih celic v svežih in shranjenih produktih je bil 4.9 ± 3.5% pri 0 h, 5.9 ± 3.8% po 24 h, 4.2 ± 3.1% po 48 h, 6.3 ± 2.6% po 4 dneh in 9.3 ± 4.6% po 6 dneh. Vsi produkti so bili sterilni.8
COBISS.SI-ID: 33342937
Cistatin F je zaviralec cisteinskih peptidaz, ki se za razliko od drugih članov družine cistatina nahaja v endosomskem / lizosomskem kompartmentu. Sintetizira se kot neaktiven dimer povezan z disulfidno vezjo, ki se nato pretvori v aktiven monomer s proteolitično cepitvijo 15 N-terminalnih ostankov. Cystatin F naj bi uravnaval citotoksičnost celic naravnih ubijalk (NK). Za preverjanje te hipoteze smo pripravili variante cistatina F in analizirali njihov prevzem v celico, potovanje po celicah in inhibicijo s paptidazami kot tudi njihov vpliv na citotoksičnost NK-92 celic in primarnih NK celic. N-glikozilacija je odgovorna za sekrecijo, privzem v celico in znotrajcelično lokalizacijo cistatina F v celicah HeLa in Hek293. Aktiven monomer cistatina F se lahko internalizira in potuje v endo/lizosomalni kompartement ter tako deluje tudi na celice, ki nimajo paptidaze. Pri mutantah za cistatin F, ki so sposobne internalizacije in potovanja do endo/lizosomalne poti je močno zmanjšana aktivnost katepsina C in H. Poleg tega inkubacija z IL-2 stimuliranih NK-92 in primarnih NK celic s cistatinom F polne dolžine in z cistatinom odrezanim na N terminalnem delu vodi v supresijo z granulami pogojene citotoksičnosti. Ta učinek je bil največji pri N-terminalno okrnjenih mutantih. Ti rezultati kažejo, da je cistatin F lahko pomemben mediator v tumorskem mikrookolju, ki vpliva na citotoksičnost NK celic in posledično naprotitumorski imunski odziv.
COBISS.SI-ID: 30930471