Z uporabo naših najnovejših študij vezave ligandov na proteinsko tarčo muramil ligazo D (MurD) smo predstavili zmogljivosti NMR metod za identifikacijo in karakterizacijo interakcij ligand-protein. Posebno pozornost smo namenili edinstveni sposobnosti NMR spektroskopije, da zagotovi kombiniran strukturno-dinamični vpogled v vezavo ligandov na proteine. Za študije NMR na osnovi opazovanja proteina smo uporabili napredno izotopsko označevanje MurD. Selektivno označeni MurD s 13CH3 skupinami je zagotovil trdno podlago za učinkovito NMR karakterizacijo specifične vezave ligandov na MurD, kar smo pokazali za različne vrste novih zaviralcev MurD. Odkrili smo hitra gibanja domen MurD, ki vplivajo na konformacijo in gibljivost vezanih ligandov, stabilnost vezavnih interakcij in prilagodljivost mesta vezave. Te dinamične procese smo nadalje raziskali z uporabo NMR eksperimentov spinske relaksacije in analizo trajektorij simulacij molekularne dinamike po normalnih načinih gibanja. Perdevtracija proteina je bila ključna za uspešno asignacijo amidnih 1H in 15N jeder glavne verige MurD v zaprtem in odprtem konfrmacijskem stanju, kar je omogočilo nadaljnje 15N NMR-relaksacijske študije gibanj domen MurD v povezavi z vezavo ligandov. Z analizo porazdelitve nizkofrekvenčnih načinov gibanja domen med procesom vezave smo pojasnili vpliv notranje dinamike proteina na spremembo proste energije pri vezavi ligandov.
B.04 Vabljeno predavanje
COBISS.SI-ID: 6691610Namen te posebne številke mednarodne revije Molecules, ki jo je urejela S. Golič Grdadolnik, je bil pritegniti prispevke o vseh vidikih uporabe NMR spektroskopije pri načrtovanju in odkrivanju molekul, ki so kandidati za razvoj zdravil, s posebnim poudarkom na študijah NMR, ki obravnavajo molekularno gibljivost glede na biološki profil molekul ali uporabnost tarč za razvoj novih zdravil.
C.03 Vabljeni urednik revije (guest-associated editor)
COBISS.SI-ID: 18462981Prof. Simona Golič Grdadolnik govori o najnovejši študiji programske skupine o dinamičnih lastnosti proteinov, ki so pomembne za načrtovanje novih zaviralcev in vodijo do novih in boljših antibiotikov. Raziskava temelji na uporabi NMR tehnik.
E.03 Drugo
COBISS.SI-ID: 6399002Za opis molekularnih determinant vezave ATP na rhNGF in opredelitev njegove funkcionalne vloge smo določili NMR strukturo nevezanega rhNGF v raztopini. NOE, pridobljene iz spektrov 3D 15N- in 13C-NOESY-HSQC, smo uporabili za konstrukcijo in validacijo 3D strukturnega modela. Struktura v raztopini je podobna strukturi, določeni z rentgensko kristalografijo za rhNGF- v kompleksu z ligandi, zlasti glede topologije cisteinskega vozla, medtem ko kaže opazne razlike znotraj fleksibilnih zank. Poleg tega je v NMR strukturi nevezanega rhNGF njegov N-terminalni del prožen in nima posebne nagnjenosti k sekundarni strukturi, medtem ko je v rentgenskih kristalnih strukturah kompleksa rhNGF-TrkA vključen v interakcijsko površino in zavzame konformacijo vijačnice. Opozoriti je treba, da ta NMR struktura ne predstavlja le prve rešene strukture rhNGF v tekočini, ampak prvo kdaj koli objavljeno strukturo nevezanega rhNGF.
F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj
COBISS.SI-ID: 14902275sometorstvo magisteriju Lanosterol 14?-demetilaza (CYP51A1) iz naddružine citokromov P450 jeesencialen encim v biosintezi holesterola. Katalitična aktivnost in strukturaCYP51 sta evolucijsko zelo ohranjeni, polega tega je polimorfnost genamajhna. V zbirki 1000 človeških genomov smo zbrali naravne polimorfizmeposameznega nukleotida (SNP), ki povzročijo drugačnosmiselno mutacijoaminokisline in imajo škodljivi napovedni vrednosti SIFT in PolyPhen-2.Postavili smo hipotezo, da zamenjavi aminokislin R271L in R425H(Q16850, UniProt) škodljivo vplivata na zvitje proteina. Zaporedji hCYP51s polimorfizmoma smo pripravili z usmerjeno mutagenezo plazmida. Obemutanti in nativni protein hCYP51 smo izrazili v bakteriji Esherichia coli in jih izolirali iz frakcij sferoplastov. S CO-diferenčnim spektrom smo preveriliprisotnost katalitično aktivne oblike encima, pri čemer je imel samo nativniprotein absorpcijski vrh pri 447 nm in s tem katalitično aktivnost.Absorpcijski vrh mutant hCYP51-R271L in hCYP51-R425H je bil pri 417 nm,kar je potrdilo prisotnost katalitično neaktivne oblike. Vpliv zamenjavaminokislin smo opredelili tudi s simulacijami molekulske dinamike in vsimulacije dodali polimorfizem D146G. Rezultati so pokazali, da zamenjaviR425H in D146G onemogočita interakcijo encima s substratom, medtem kozamenjavi R271L in D146G škodljivo vplivata na interakcijo z redokspartnerjem P450 citokrom oksireduktaza. Ker pridobljeni mutanti hCYP51nista bili aktivni, saj nista imeli vrha v CO-diferenčnem spektru pri 445 nm,nismo preverili encimske učinkovitosti in vitro. Sklepamo, da zamenjaviR271L in R425H povzročita škodljive spremembe v sicer ohranjeni strukturihCYP51. Spremembe v strukturi onemogočijo nastanek hem-tiolatne vezi vaktivnem mestu in zato je protein neaktiven.
D.10 Pedagoško delo
COBISS.SI-ID: 1537489347