Avtoimunske bolezni, med katere spada tudi diabetes tipa 1, se pogosto razvijejo kot posledica upada mehanizmov imunske tolerance. Pomemben del slednje predstavljajo podskupina T limfocitov, imenovanih regulatorne T celice (Treg), ki s svojo imunosupresivno funkcijo preprečujejo avtoimunsko delovanje lastnih celic in katerih umanjkanje ali nedelovanje je lahko pogosto pomemben faktor v razvoju avtoimunskih bolezni. Za njihov razvoj iz timocitov je ključno stabilno izražanje transkripcijskega faktorja FOXP3, ki deluje kot glavni regulator diferenciacije Treg. Zadostna aktivacija izražanja FOXP3 v drugih T-limfocitih ali celo sorodstveno bolj oddaljenih celicah bi lahko bil zadosten signal za diferenciacijo v Treg in pridobitev imunosupresivnega fenotipa. V magistrskem delu smo poskušali ustvariti in preizkusiti transkripcijske dejavnike, vezane na Cas9 proteine, za specifično aktivacijo izražanja FOXP3. Za usmerjanje Cas9 proteinov na tarčno mesto smo ustvarili različne vodilne RNA (sgRNA) molekule, ki so prepoznale specifična mesta na ključnih regulatornih mestih gena FOXP3. S poskusi in vivo smo dosegli visoko povišanje ob uporabi trodelnega aktivatorja VPR, vezanega na Cas9 protein z izničeno nukleazno aktivnostjo (dCas9:VPR). Najvišjo aktivacijo izražanja FOXP3 smo dobili ob ciljanju promotorske regije gena FOXP3 ter regulatorne regije, katero smo poimenovali Cage1. Po optimizaciji aktivacije izražanja smo prav tako preverili spremembo izražanja ključnih tarčnih genov proteina FOXP3 v celicah, ki imajo FOXP3 utišan. Uvodni poskusi aktivacije izražanja FOXP3 v celični liniji HEK293T so pokazali določeno mero ujemanja izražanja tarčnih genov s Treg celicami. Z nalogo smo pokazali moč metode za tarčno aktivacijo izražanja ter potrdili pomembnost regije Cage1 za tarčno aktivacijo. Metoda bi lahko bila močno orodje pri poskusih diferenciacije celic v Treg, kar bi lahko bilo zlasti pomembno pri terapijah za razne avtoimunske bolezni.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 8723833Uporaba načrtovanih DNA-vezavnih proteinov za natančen nadzor transkripcije poljubnih genov predstavlja enega izmed ključnih izzivov sintezne biologije. Do danes razviti pristopi temeljijo na genski fuziji efektorskih domen na načrtovane DNAvezavne domene oziroma na kompetitivni vezavi načrtovanih DNA-vezavnih domen z endogenimi transkripcijskimi faktorji. V tej nalogi smo preučevali vpliv vezave načrtovanih TALE (ang. transcription activator-like effector) proteinov v bližino transkripcijskih aktivatorjev na osnovi cinkovih prstov Zif268 in Gal4. Ugotovili smo, da lahko z vezavo TALE proteinov v njuno bližino vplivamo na moč transkripcijske aktivacije, efekt pa je odvisen od pozicije in razdalje med vezavnimi mesti. TALE proteine lahko načrtujemo za vezavo v bližino endogenih transkripcijskih faktorjev, s čimer bi lahko nadzorovali izražanje endogenih genov celice.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 4857208Imunska toleranca predstavlja skupino mehanizmov, ki zavirajo aktivacijo imunskega sistema v prisotnosti organizmu lastnih molekul in s tem preprečujujo razvoj avtoimunskih bolezni. Regulatorne T-celice (Treg) so specializirana celična linija, ki zavirajo aktivacijo ostalih T limfocitov, imunosupresivno pa delujejo tudi na druge imunske celice, med drugim limfocite B in antigen predstavitvene celice. Treg celice se razvijejo v timusu ali pa v perifernih organih iz naivnih T celic ob vezavi T celičnega receptorja na peptid predstavljen v MHC II v prisotnosti ustrezne kombinacije citokinov v celičnem mikrookolju. Diferenciacijo T celic v Treg sproži aktivacija ključnega transkripcijskega regulatorja, ki nadzoruje diferencijacijo regulatornih T celic, FOXP3. FOXP3 v kompleksu z drugimi proteini deluje kot aktivator in represor transkripcije več kot 700 genov, odgovornih za vzpostavitev specifičnega Treg profila. Mutacije v FOXP3 in druge napake, ki vodijo do pomanjkanja ali slabšega delovanja regulatornih T celic privedejo do razvoja avtoimunih bolezni, kroničnih vnetij in alergij, v živalskih modelih pa so pokazali, da vnos delujočih Treg izboljša omenjena stanja. Zaradi njihovega terapevtskega potenciala se razvijajo metode za povečanje števila Treg, najpogosteje z ex vivo namnoževanjem naravno prisotnih Treg, ali pa z diferenciacijo konvencionalnih limfocitov T v Treg. Modifikacija sistema CRISPR/Cas9, pri kateri uporabimo Cas9 brez nukleazne aktivnosti (dCas9) s fuziranim transkripcijskim aktivatorjem VPR omogoča tarčno specifično aktivacijo enega ali večih genov hkrati. Tako predstavlja uporaba dCas9-VPR v kombinaciji s tarčno specifičnimi sgRNA natančen in enostaven pristop k specifični aktivaciji izražanja genov. V magistrski nalogi smo želeli doseči aktivacijo oziroma povečanje izražanja določenih genov, ključnih za sprožitev diferenciacije konvencionalnih celic T v Treg. Uporabili smo protein dCas9-VPR in kombinacijo sgRNA za aktivacijo tarčnih genov v primarni in trajni celični liniji T celic, ter določili vpliv aktivacije na spremembo izražanja navzdol genov. Določili smo optimalne pogoje elektroporacije celic in pokazali povečanje izražanja FOXP3 ob vnosu dCas9-VPR in sgRNA v primarne celice limfocitov T ter vpliv aktivacije FOXP3 na štiri ključne navzdol gene, IL2RA, CTLA-4, SATB1 in TIGIT. V celični liniji Jurkat smo optimizirali kombinacijo sgRNA uporabljenih za aktivacijo FOXP3 z uporabo sgRNA, ki privedejo kompleks dCas9-VPR na različne, za aktivacijo pomembne regije v okolici gena FOXP3 in tako dosegli dodatno povečanje učinkovitosti aktivacije. Na mRNA in proteinskem nivoju smo analizirali spreminjanje izražanja FOXP3 skozi daljše časovno obdobje po elektroporaciji in pokazali, da je stopnja izražanja gena povišana tudi štiri dni po vnosu konstruktov. Načrtovali smo tudi dodatna sgRNA zaporedja, ki se prilegajo na promotorska zaporedja drugih genov pomembnih pri aktivaciji Treg ekspresijskega profila. Uspelo nam je aktivirati izražanje gena EOS in koaktivirati dva gena, FOXP3 in EOS hkrati in pokazati, da se izražanje FOXP3 v prisotnosti EOS še dodatno poveča. V magistrskem delu smo tako pokazali, da lahko z uporabo sistema dCas9-VPR in sgRNA ciljane na različne regulatorne elemente tarčnih genov uspešno aktiviramo izražanje enega ali večih genov, pomembnih za diferenciacijo Treg, kar bo lahko pripomoglo k razvoju uspešnejših terapij za zdravljenje avtoimunih bolezni.
E.01 Domače nagrade
COBISS.SI-ID: 1538039747Debelost in z njo povezana sladkorna bolezen tipa 2 (SBT2) sta med najbolj razširjenimi boleznimi sodobnega časa. Na svetu je 13% odraslih debelih in 39 % prekomerno težkih, za SBT2 pa trpi okrog 8 % svetovne populacije. Zaenkrat še ne poznamo učinkovite terapije, ki bi uspešno zdravila ali celo preprečevala obe bolezni, hkrati pa ne bi imela sistemskih in/ali centralnih učinkov. Tst kot eden redkih genov z dokazano vlogo pri ohranjanju metabolično zdravega fenotipa predstavlja potencialno zelo zanimivo terapevtsko tarčo. Na podlagi dokazane korelacije med visokim izražanjem Tst in nizkim deležem maščevja ter nizkim deležem plazemske glukoze pri miših in ljudeh smo v trajni celični liniji mišjega izvora, NIH3T3, s sistemom CRISPR/dCas9-VPR poskušali povečati izražanje Tst. To bi lahko služilo kot osnova za razvoj učinkovite terapije za zdravljenje SBT2 in debelosti. Na osnovi regulatornih elementov na lokusu Tst smo izbrali potencialno ustrezno tarčno regijo za vezavo sgRNA. Glede na izbrano tarčno zaporedje smo zasnovali sgRNA. S cepitvijo DNA in vitro in s testom z vektorjem pCAG-EGxxFP v celicah HEK293 smo dokazali, da se izbrana sgRNA ustrezno veže na tarčno DNA tako in vitro kot v celičnem okolju. Preko uspešnega povečanja izražanja gena Oct4 smo se prepričali, da tudi proteinska fuzija dCas9-VPR iz vektorja pCMV-dCas9:NLS:VPR v celicah NIH3T3 deluje ustrezno in je pri aktivaciji izražanja genov učinkovitejša od fuzije dCas9-VP64. S kombinacijo zasnovane sgRNA in proteinske fuzije dCas9-VPR iz vektorja pCMV-dCas9:NLS:VPR smo nato poskušali povečati izražanje Tst v celicah NIH3T3, vendar signifikantne aktivacije transkripcije nismo opazili. Najverjetnejši vzroki za to so prenizka učinkovitost transfekcije in/ali neustrezno izbrana tarčna regija za vezavo sgRNA in/ali odsotnost konstitutivnega izražanja sgRNA zaradi vnosa slednje v sintetični obliki. Kljub temu, da izražanja Tst nismo uspeli signifikantno povečati, verjamemo, da smo v diplomskem delu prišli do nekaterih ugotovitev, ki bi lahko služile kot opora pri nadaljnjih poskusih povečanja izražanja Tst, potencialno pa tudi drugih genov, s sistemom CRISPR/dCas9 in s tem pri razvoju terapij za debelost, SBT2 in druge bolezni, ki bi jih bilo mogoče zdraviti preko vpliva na izražanje določenega/-ih gena/-ov.
B.06 Drugo
COBISS.SI-ID: 1538397123Ozadje: Sistem CRISPR / Cas je zelo močno orodje, ki je revolucioniralo gensko inženirstvo in regulacijo transkripcije genov v različnih celicah in organizmih. To orodje za urejanje genov je sestavljeno iz vodilne RNA (gRNA), ki usmerja endonukleazo Cas9 na želeno genomsko mesto. Cas9 katalizira nastanek dvoverižnih prelomov DNA, ki jih nato popravijo različni celični mehanizmi. Glede na velikost (deset baznih parov) indelnih mutacij je mogoče doseči višje stopnje "knock-out". Da bi dosegli večje indelacijske mutacije, lahko sistem CRISPR v celicah sočasno izražamo z eksonukleazami DNA, ki povzročijo povečane recesije DNA po prelomih DNA. Pokazali smo, da skupno delovanje sistema CRISPR z različnimi eksonukleazami znatno poveča odstotek indelacijskih mutacij na različnih ciljnih genih. Med različnimi preizkušenimi eksonukleazami je eksonukleaza III, pridobljena iz E. coli (EXOIII), pokazala najboljše rezultate glede nastajanja indela. Material in metode: Uporabljene so bile celice K562, model za pozitivne celice s kromosomom Philadelphia in bolniške celice s kronično mielogeno levkemijo (CML). Konstrukti, ki izražajo BCR-ABL1, usmerjene na gRNA in Cas9, privezani s pomočjo peptidov, ki tvorijo tuljavo, na E. coli eksonukleazo EXOIII, so bili nukleoficirani v ciljne celice. Izveden je bil test T7E1 za odkrivanje sprememb genoma. Za določanje celične smrti smo uporabili TUNEL test, analizo FACS z merjenjem bioluminiscence. Miše SCID smo uporabili za podkožni model raka K562. Rezultati: Med različnimi testiranimi eksonukleazami je EXOIII pokazal najboljše rezultate v smislu nastajanja indela. Da bi izboljšali stopnjo indelacijskih mutacij, smo Cas9 in EXOIII povezali s peptidi, ki tvorijo tuljave, in oba encima približali. To je povzročilo povečano tvorjenje indela v primerjavi s klasičnim sistemom CRISPR / Cas. Izvedli smo študijo primera za uporabo našega novega sistema CRISPR kot potencialnega terapevtskega orodja proti raku. V primeru našega novega sistema smo pokazali znatno povečanje celične smrti zaradi večje modifikacije genoma v regiji BCR-ABL1. Kasneje so bile te ugotovitve potrjene tudi v modelu raka živali, kjer so živali s tumorji, elektroporirane s sistemom CRISPR-EXO, pokazale 100% preživetje in drastično zmanjšanje velikosti tumorja. Zaključek: Naš novo nadgrajeni sistem CRISPR z vezavo beljakovin Cas9 na eksonukleazo EXOIII s heterodimernimi peptidi, ki tvorijo tuljavo, je povzročil večje urejanje fuzijskega gena BCR-ABL1, kar je privedlo do večje smrti rakavih celic CML.
B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci
COBISS.SI-ID: 44496899