Pri tej magistrski nalogi smo poskušali razviti in preizkusiti transkripcijske dejavnike, vezane na Cas9 proteine, za specifično aktivacijo izražanja FOXP3, ki je ključen za diferenciacijo regulatornih celic T (Treg) – naloga je bila vključena v aktivnosti 1. sklopa predlaganih poskusov v projektni vlogi. Za usmerjanje Cas9 proteinov na tarčno mesto smo ustvarili različne vodilne RNA (sgRNA) molekule, ki so prepoznale specifična mesta na ključnih regulatornih mestih gena FOXP3. S poskusi in vivo smo dosegli visoko povišanje ob uporabi trodelnega aktivatorja VPR, vezanega na Cas9 protein z izničeno nukleazno aktivnostjo (dCas9:VPR). Najvišjo aktivacijo izražanja FOXP3 smo dobili ob ciljanju promotorske regije gena FOXP3 ter regulatorne regije, katero smo poimenovali Cage1. Po optimizaciji aktivacije izražanja smo prav tako preverili spremembo izražanja ključnih tarčnih genov proteina FOXP3 v celicah, ki imajo FOXP3 utišan. Uvodni poskusi aktivacije izražanja FOXP3 v celični liniji HEK293T so pokazali določeno mero ujemanja izražanja tarčnih genov s Treg celicami. Z nalogo smo pokazali moč metode za tarčno aktivacijo izražanja ter potrdili pomembnost regije Cage1 za tarčno aktivacijo. Metoda bi lahko bila močno orodje pri poskusih diferenciacije celic v Treg, kar bi lahko bilo zlasti pomembno pri terapijah za razne avtoimunske bolezni.
F.35 Drugo
COBISS.SI-ID: 8723833Pri tem diplomskem delu smo načrtovali in analizirali možnost spreminjanja izražanja genov LEF1, GATA1, GATA3 in IRF4. Gre za ključne gene, ki, poleg gena FOXP3, sodelujejo pri vzpostavitvi stabilnega fenotipa T-regulatornih limfocitov. Njihovo izražanje lahko sprožimo z uporabo sistema CRISPR/dCas9, pri čemer so regulatorne regije izbranih genov uporabljene kot ciljna zaporedja DNA za vezavo sgRNA, ki vodijo nukleazo dCas9 na izbrano tarčno mesto v genomu celic. Eksperimentalno delo je potekalo na modelnih celicah Jurkat, ki smo jih elektroporirala s plazmidi, ki nosijo vključke za sgRNA, ciljane na regulatorne regije izbranih genov, ter plazmidom za zapis proteina dCas9 z vezavno aktivacijsko domeno VPR (dCas9-VPR). Sledila je izolacija mRNA, reverzna transkripcija v cDNA ter reakcija RT-PCR pri kateri sem določila relativno izražanje gena na ravni transkripcije. Do zaželenega odziva celic je prišlo pri uporabi sgRNA, ki ciljajo gena LEF1 in GATA3. Prav tako je elektroporacija kombinacije sgRNA za regulatorne regije vseh štirih genov skupaj tudi vplivala na povečanje izražanja gena FOXP3.
F.35 Drugo
COBISS.SI-ID: 1537596611