Tehnologija CRISPR/Cas9 je dandanes najbolj pogosto uporabljena tehnologija za preurejanje genomov ljudi, živali, mikrobov in rastlin. V kombinaciji z ogromno količino dostopnih genomskih in transkriptomskih podatkov predstavlja velik potencial tudi za žlahtnjenje rastlin in rastlinsko biotehnologijo. Trenutno najpogostejši način vnosa CRISPR/Cas9 v rastlinske celice je s prehodno ali stabilno transformacijo z DNA vektorji, kar ima lahko določene neželene lastnosti, kot so (prehodna) faza transgeneze ter nevarnosti insercijske mutageneze in povzročanja mutacij na ne-tarčnih mestih. Te neželene učinke je mogoče preprečiti z uporabo ribonukleoproteinskih (RNP) kompleksov, ki so pripravljeni iz encima Cas9 in in vitro prepisane ali sintetizirane vodilne RNA molekule (sgRNA). Namen raziskave je bil vzpostavitev protokola za tarčno mutagenezo različnih vrst rodu Brassica (zelja, kitajskega zelja in oljne ogrščice) s pomočjo vnosa RNPjev v protoplaste s PEG4000. Za ta namen so bile oblikovane štiri sgRNA, ki so se prilegale na dva enodogena gena (PDS in FRI). Uporabljene so bile štiri koncentracije vnesenih sgRNA in encima Cas9 (7,5; 15; 30 in 60 µg), pri čemer je bila ugotovljena pozitivna korelacija med količino vnesenega RNPja in odstotkom induciranih INDEL mutacij že 24 ur po transfekciji. Odstotek induciranih mutacij, analiziran 72 ur po transfekciji, se ni bistveno razlikoval od rezultatov pridobljenih 24 ur po transfekciji. Rezultati, pridobljeni s sekvenciranjem naslednje generacije, so pokazali, da je bil pri zelju odstotek INDEL mutacij od 0,09 do 2.25% in pri kitajskem zelju od 1,15 do 24,51%. Uspešnost induciranja mutacij je bila odvisna od rastlinske vrste, ciljanega gena in lokusa.
COBISS.SI-ID: 9081209
CRISPR/Cas9 je vsestransko in učinkovito orodje za tarčno preurejanje genomov, ki se uporablja pri številnih rastlinskih vrstah. V naših poskusih smo primerjali dve najpogosteje uporabljeni metodi prehodne transformacije za tarčno preurejanje genoma rdečega zelja (Brassica oleracea var. capitata f. rubra): transformacijo protoplastov in infiltracijo bakterije Agrobacterium tumefaciens, da bi razvili hiter in učinkovit protokol za preverjanje delovanja kloniranih plazmidnih vektorjev. Vektorje, zasnovane za ciljanje štirih različnih regij v genomu zelja (dva modelna gena in dve različni regiji v genu za centromerni protein (CENH3)), smo vnesli v dve sorti rdečega zelja: 'Huzaro F1' in 'Rebecca F1'. Analiza sekvenciranja naslednje generacije je pokazala, da so vektorji CRISPR/Cas9 povzročili mutacije v obeh sortah in na vseh tarčnih mestih. Odstotki nastalih mutacij so bili od 1,27 do 11,95% po transformaciji protoplastov in od 0,07 do 14,42% po agroinfiltraciji. Naši rezultati kažejo uspešno tarčno mutagenezo z uporabo dveh različnih pristopov za hitro oceno učinkovitosti vektorjev s CRISPR/Cas9 pri zelju.
COBISS.SI-ID: 9287545