Zdravljenje bolnikov s kronično limfocitno levkemijo (KLL) se je v zadnjem času bistveno izboljšalo z odobritvijo novih zdravil, kot so ibrutinib, idelalisib in venetoklaks. Kljub temu, da so te spojine zelo učinkovite in odobrene za zdravljenje bolnikov z neodzivno boleznijo, pri ponovitvi bolezni ali del17p, se številni bolniki še vedno ne odzovejo na zdravljenje oziroma imajo relapse bolezni. Konstitutivna aktivacija NF-?B, ki ščiti celice KLL pred apoptotičnimi dražljaji, predstavlja enega izmed molekularnih mehanizmov, ki so odgovorni za rezistenco na zdravila. Ker se je izkazalo, da agonisti prostaglandinskega receptorja E (EP) 4 uspešno zavirajo pot NF-?B v celicah B-celičnega limfoma, smo želeli ugotoviti ali lahko uporabimo zelo specifični agonist receptorja EP4 L-902688 za zdravljenje bolnikov s KLL. Ugotovili smo, da lahko nizke mikromolarne koncentracije L-902688 povzročijo selektivno citotoksičnost na več malignih celicah B, vključno s KLL. Poleg tega je aktivacija EP4, ki jo je povzročil L-902688, na celicah CLL povzročila inhibicijo signalne poti NF-?B in inhibicijo celične proliferacije ter indukcijo apoptoze. Najpomembneje pa je, da smo prvič pokazali, da L-902688 v kombinaciji z ibrutinibom, idelalisibom ali venetoklaksom povzroča sinergistično citotoksično aktivnost proti celicam CLL. Modulacija NF-?B aktivnosti z agonisti receptorja EP4 predstavlja inovativen pristop za izboljšanje zdravljenja bolnikov s KLL. Agonisti receptorja EP4 zato lahko predstavljajo obetaven dodatek k že obstoječim terapijam za bolnike s KLL.
COBISS.SI-ID: 43415299
Zanesljivi modeli bolezni in zdravih kontrol, ki napovedujejo človeške odzive, so nujno potrebni v predklinični oceni učinkovitosti in varnosti novih zdravil. Kronična limfocitna levkemija (KLL) je maligna bolezen zrelih celic B, ki so zelo odvisne od interakcij s tkivnim mikrookoljem. Pri iskanju novih zdravil za zdravljenje KLL je velikega pomena vzpostavitev zanesljivih in vitro modelov. Razpoložljivost primarnih celic B pridobljenih iz pacientov je dober pristop. Kljub dolgotrajnemu preživetju malignih celic B in vivo pa se le-te ne razmnožujejo in umrejo in vitro. Cilj te študije je bil vzpostavitev endogenih pogojev za rast kot model bolezni in vitro. Zato smo primarne celice KLL stimulirali z a) sintetičnim oligonukleotidom DSP30 s CpG motivom, ki aktivira imunske celice s povečanjem izražanja receptorjev interlevkina 2 (IL-2) v kombinaciji z IL-2; b) ionomicinom, kalcijevim ionoforom, ki poveča intracelularni kalcij in v kombinaciji s PMA aktivira protein kinazo C, kar posnema aktivacijo B-celičnega receptorja; in c) LPS, ki aktivira TLR4. Maligne celice B, pridobljene po informiranem soglasju bolnikov z diagnozo KLL, smo inkubirali z IL-2/DSP30, ionomicinom/PMA in LPS 24 ur in 48 ur. Preživetje celic smo merili s presnovno aktivnostjo s testom PrestoBlue, ki temelji na resazurinu. Stimulacija celic KLL (N = 19) z IL-2/DSP30 je povečala živost celic 2-krat (206 %) po 24 urah in 4-krat (389 %) po 48 urah. Ko so bile celice KLL (N = 16) stimulirane z ionomicinom/PMA, se je živost celic po 24 urah povečala na 171 % in po 48 urah na 360 %. Inkubacija celic KLL (N = 16) z LPS je privedla do 129 % in 136 % povečane živosti celic po 24 oz. 48 urah. Isti trend povečanja živosti celic smo opazili pri vseh testiranih vzorcih KLL, ki so jim bili dodani IL2/DSP30 ali ionomicin/PMA, vendar so bile opažene razlike med posamezniki, kar je v skladu z dejstvom, da je KLL zelo heterogena bolezen. Stimulacijo celic KLL z IL-2/DSP30 in ionomicinom/PMA smo tako identificirali kot dragocen in vitro model. Nato smo ocenili prostaglandinski receptor EP4 kot tarčo v KLL. Kot modelno zdravilo v tej študiji smo izbrali selektivni agonist EP4 receptorja, PgE1-OH, za katerega se je predhodno izkazalo, da inducira apoptozo v malignih celicah B (1, 2). PgE1-OH je bil citotoksičen v odvisnosti od odmerka na celicah KLL, stimuliranih z IL2/DSP30, ionomcinom/PMA kot tudi LPS. Poleg tega je aktivacija celic z ionomicinom/PMA povzročila povečanje ravni TNF?, ki je pomemben rastni dejavnik za celice KLL. Predhodna izpostavitev celic KLL (N = 10) PgE1-OH zmanjša produkcijo TNF?, kar kaže na koristne imunomodulatorne lastnosti PgE1-OH v KLL. To je v skladu z našo prejšnjo študijo, v kateri smo ovrednotili imunomodulatorne lastnosti PgE1-OH v človeških limfoblastoidnih celičnih linijah, napovednem in vitro modelu za presejanje na imunotoksičnost spojin (3). Skratka, primarne celice KLL, stimulirane z ionomcinom/PMA, so bile identificirane kot dragocen in vitro model bolezni za predklinično vrednotenje zdravil in uporabljene za vrednotenje novega kandidata za zdravilo PgE1-OH.
COBISS.SI-ID: 4615793
Izkazalo se je, da signaliziranje prostaglandinskega receptorja EP4 preprečuje proliferacijo, posredovano z B-celičnim receptorjem (BCR), in predstavlja novo strategijo za izboljšanje zdravljenja malignih obolenj celic B, za katere je znano, da je njihovo preživetje odvisno od BCR signalov. Kronična limfocitna levkemija (KLL) je najpogostejše hematološko maligno obolenje pri odraslih in je trenutno neozdravljiva bolezen. V naših prejšnjih raziskavah smo pokazali, da selektivni agonist receptorja EP4 zavira NF-?B signalno pot, kar ima za posledico povečano apoptozo malignih celic B. Namen te študije je bil ovrednotiti receptor EP4 kot potencialno tarčo za zdravljenje KLL (1, 2). Maligne celice B smo izolirali iz polne krvi, pridobljene po obveščenem pristanku bolnikov s KLL. Ekspresija receptorja EP4 je bila višja na celicah KLL v primerjavi z limfoblastoidnimi celičnimi linijami (LCL), pridobljenimi od zdravih darovalcev. Agonist receptorja EP4, PgE1-OH, je povzročil koncentracijsko in časovno odvisno citotoksičnost na vseh 151 testiranih celicah KLL. Učinke proti raku posredujemo preko receptorja EP4, kot je razvidno iz močnejših citotoksičnih učinkov selektivnega agonista receptorja EP4 v primerjavi z endogenim ligandom PgE2 in dejstvom, da antagonist receptorja EP4 preprečuje apoptozo, posredovano s PgE1-OH. Ocenili smo selektivnost PgE1-OH proti KLL celicam z uporabo LCL in mononuklearnih celic periferne krvi (PBMC), pridobljenih od zdravih posameznikov. Povprečne vrednosti EC50 za PgE1-OH po 24 urah so bile 13,53 µM na celicah KLL (N = 151), 55,43 µM na LCL (N = 24) in 46,36 µM na PBMC (N = 21), kar kaže, da je bil PgE1-OH v primerjavi z imunskimi celicami, izoliranimi od zdravih posameznikov, bistveno bolj citotoksičnih za maligne celice B. PgE1-OH je pokazal citotoksične učinke na vseh celicah KLL s EC50 vrednostmi od 2 do 55 µM, kar kaže na interindividualno variabilnost v odzivu na PgE1-OH, kar je v skladu z dejstvom, da je KLL zelo heterogena bolezen. Analiza rezultatov je pokazala od spola odvisno občutljivost celic KLL na PgE1-OH, ki je bil bolj citotoksičen za celice moških kot žensk. PgE1-OH je bil tudi bolj citotoksičen proti celicam nosilcev variante A alela EP4 receptorsko modulirajočega polimorfizma rs4495224. Poleg tega so imeli moški bolniki višji nivo ekspresije Ptger4, ki kodira za receptor EP4, v primerjavi z ženskami, kot so ga imeli tudi donorji z genotipom rs4495224 AA v primerjavi s tistimi z rs4495224 AC / CC genotipom. Prikazana je bila tudi šibka, vendar statistično značilna korelacija med povečano ekspresijo gena Ptger4 in nižjimi vrednostmi EC50. Poleg tega je bil PgE1-OH citotoksičen na celicah KLL, pridobljenih od bolnikov v stadiju A, B in C po Binetu, ter je induciral apoptozo v celicah KLL, izoliranih iz krvi bolnikov z delecijo p53, za katere je znano, da so odporni na standardno citotoksično terapijo. PgE1-OH je deloval sinergistično s fludarabinom v terapevtskih koncentracijah v razponu od 3 do 5 µM. Poleg tega smo odkrili zelo močan sinergizem, ko smo celice tretirali s PgE1-OH in idelalizibom (kombinacijski indeks (0,1) kot tudi z ibrutinibom, kar bi lahko zagotovilo nove terapevtske možnosti za zdravljenje KLL. EP4 receptor je bil tako opredeljen kot obetavna terapevtska tarča za zdravljenje KLL.
COBISS.SI-ID: 4572017
Kronična limfocitna levkemija (KLL) je najpogostejša vrsta levkemije pri odraslih v zahodnih državah, ki prizadene B celice, za katero je značilna velika heterogenost v kliničnem poteku. Nekateri bolniki ostanejo brez simptomov in morda ne bodo potrebovali zdravljenja desetletja, drugi pa hitro razvijajo agresivno obliko, ki zahteva takojšen terapevtski poseg. Zdravljenje lahko vključuje kemoterapijo, kemoimunoterapijo ali zdravila, ki ciljajo na signalne poti, ki spodbujajo preživetje in/ali rast celic KLL.1 Vendar naraščajoča odpornost na ta zdravila predstavlja resen problem in spodbuja iskanje inovativnih in učinkovitih tarč za zdravljenje bolnikov s KLL. Receptor EP4 je eden od štirih receptorjev prostaglandina E (EP) (EP1, EP2, EP3 in EP4), ki prepozna prostaglandin E2 (PGE2) kot naravni vezavni ligand in je bil prepoznan kot glavna molekula, ki posreduje učinek PGE2, ki zavira rast nezrelih in zrelih malignih celic B.2-4 Naša raziskovalna skupina je pokazala, da je agonist receptorja EP4 1-hidroksiprostaglandin E1 povzročil preko kaspaz posredovano apoptozo in zmanjšal aktivnost NF-?B v celicah Burkittovega limfoma, kar ima za posledico povečano občutljivost celic na kemoterapevtske učinke bortezomiba in doksorubicina.5 Zaradi obetavnih rezultatov, pridobljenih v predhodnih študijah, so bili izbrani agonisti receptorja EP4 ovrednoteni glede na njihov potencial, da povzročijo apoptozo celičnih linij KLL (MEC-1 in MEC-2) kot tudi primarnih celic KLL v primerjavi z nemalignimi kontrolnimi celicami. Med njimi selektivni agonist receptorja EP4 L-902688 kaže citotoksično aktivnost tako na celičnih linijah kot na primarnih celicah KLL v nizkem mikromolarnem območju in po 24 urah inkubacije kaže selektivnost do mononuklearnih celic periferne krvi. Poleg tega L-902688 zavira proliferacijo, ki smo jo določili z barvanjem s CFSE, in inducira apoptozo, kar potrjuje barvanje z aneksinom V/Sytox Blue in povečanje populacije sub-G1 pri analizi celičnega cikla. Aktivacija receptorja EP4 modulira več signalnih poti. S preučevanjem ravni fosforilacije več efektorjev na nižji stopnji, kot so Akt, MEK, ERK, CREB, p105 in I?B?, smo ugotovili, da L-902688 zmanjšuje aktivnost NF-?B. Opaženi učinek je koristen, saj je ta pot povečano aktivna v celicah KLL. Poleg tega je bil L-902688 preizkušen tudi v kombinacijah zdravil, ki se že uporabljajo pri zdravljenju KLL (ibrutinib, idelalizib), saj uporaba kombinacij zdravil, ki imajo sinergistične učinke, omogoča zmanjšanje terapevtsko učinkovitih odmerkov, hkrati pa zmanjšuje toksičnost proti normalnim celicam. Naši rezultati kažejo, da kombinacije L-902688-ibrutinib / idelalizib izkazujejo sinergistično protirakavo delovanje proti celicam KLL. Za zaključek so agonisti receptorjev EP4 s svojo sposobnostjo modulacije aktivnosti NF-?B zanimiva alternativa za razvoj novih terapij za KLL. Zlasti agonisti receptorjev EP4 bi lahko bili odličen dodatek k že obstoječim terapijam za paciente s kLL zaradi njihovega sinergičnega citotoksičnega delovanja.
COBISS.SI-ID: 4742001
Uvod: Kronična limfocitna levkemija (KLL) je hematološka maligna bolezen, za katero je značilno postopno kopičenje na videz zrelih monoklonskih CD5 +, CD19 +, CD20 + in CD23 + limfocitov B v krvi, kostnem mozgu in sekundarnih limfoidnih organih. Na voljo je več terapij za KLL, na primer kemoimunoterapija, sestavljena iz fludarabina, ciklofosfamida in anti-CD20 monoklonskega protitelesa rituksimaba ter novih ciljnih terapij, vključno z ibrutinibom, idelalizibom in venetoklaksom.1 Kljub temu, da so zaviralci proteasoma (ZP) učinkovita zdravila za zdravljenje multiplega mieloma, še vedno niso bili uporabljeni za KLL.2 Predpostavili smo, da so lahko ZP kot alternativa trenutnim terapijam ali kot del strategije kombiniranja učinkovin uporabijo v primeru ponovljene in odporne KLL. Rezultati: Ocenili smo jakost s strain FDA odobrenih ZP karfilzomiba (CFZ), bortezomiba (BTZ) in iksazomiba (IXA) na celični liniji, odporni proti fludarabinu, MEC-1.2,3 CFZ je izkazal najbolj močne citotoksične učinke in induciral preko kaspaz posredovano celično smrt, kar smo potrdili s pan-kaspaznim zaviralcem Q-VD-OPh in s pretočno citometrijo. Poleg tega je CFZ deloval sinergistično z ibrutinibom, idelalizibom in venetoklaksom. Ker se odpornost na CFZ verjetno pojavi pri dolgotrajni izpostavljenosti malignim celicam, smo razvili celično linijo, odporno na CFZ. Celice smo gojili ob prisotnosti postopoma naraščajočih koncentracij CFZ od 5 nM, dokler niso pokazale trajne rasti v prisotnosti 50 nM CFZ, in jih poimenovali MEC-1 CFZR. Na MEC-1 CFZR smo testirali jakost CFZ, BTZ in IXA in v primerjavi z MEC-1. EC50 vrednosti bile 7-, 1-2- in 1-2- višje. Nato smo raziskali mehanizem odpornosti na CFZ. MEC-1 CFZR smo tretirali z ZP v prisotnosti/odsotnosti selektivnega zaviralca p-gp elakridarja za 24 ur, čemur je sledilo določanje viabilnosti z testom MTS. Nadalje smo spretočno citometrijo izvedli test aktivnosti p-gp, pri čemer je bil kot substrat p-gp uporabljen rodamin 123. Rezultati kažejo, da je odpornost MEC-1 CFZR na CFZ posledica povečane aktivnosti p-gp, saj se je citotoksičnost CFZ znatno povečala, izmet rodamina 123 elakridarja bistveno zmanjšal v prisotnosti elakridarja. Zaključki: Dokazali smo, da so ZP citotoksični na celicah KLL, ki so odporne na fludarabin. Poleg tega smo razvili na CFZ odporni in vitro model CLL in opredelili povečano aktivnost p-gp kot mehanizem, ki poganja odpornost na CFZ. Ker zaviranje p-gp povrne citotoksičnost CFZ, predlagamo, da se v primeru odpovedi CFZ uporabi elakridar. Poleg tega je MEC-1 CFZR pokazal minimalno navzkrižno odpornost na druge ZP, kar pomeni, da se BTZ in IXA lahko uporabljata kot alternativa za KLL, odporno na CFZ.
COBISS.SI-ID: 4742513