Rastlinske celice ob okužbi z glivami izločajo hitinaze, ki razgrajujejo hitin. Nastale razgradne produkte prepoznajo specializirani imunski receptorji in sprožijo vrsto obrambnih odzivov rastlinskih celic na hitin. V tej študiji smo poročali o hitin vezavnemu proteinu, VnaChtBP, ki ga izloča fitopatogena gliva Verticillium nonalfalfae, da se zaščiti pred razgradnjo z rastlinskimi hitinazami in zatre s hitinom sprožen imunski odziv rastlin. V sodelovanju z raziskovalnima skupinama iz Wageningen University & Research ter James Hutton Institute smo kot prvi pojasnili molekularni mehanizem vezave hitina, ki, za razliko od že znanih hitin vezavnih glivnih proteinov z domenami LysM oziroma Avr4, vključuje strukturno drugačen motiv CBM18. Kljub temu imajo vse tri skupine proteinov enotno delovanje: preprečujejo razgradnjo glivne celične stene ter zavirajo imunski odziv rastlin. Objava je bila s strani urednice revije Molecular plant-microbe interactions (APS Press) v letu 2020 izbrana za objavo meseca oktobra in bila hkrati največkrat prenesena objava v letu 2020.
COBISS.SI-ID: 9214841
Testiranje in določanje kombinacijskih sposobnosti velikega števila linij, je z vidika pridobivanja hibridnih sort izredno omejujoč faktor. Metoda žlahtnjenja, ki jo je razvila naša skupina, omogoča določanje kombinacijskih sposobnosti večjega števila linij, ki jih pridobimo z indukcijo podvojenih haploidov s kulturo mikrospor. Linije izhajajo iz heterozigotnega materiala in so posledično genetsko zelo različne, kar smo potrdili tudi z genotipizacijo. Genetsko različne linije lahko posadimo skupaj in jih križamo z opraševalci. Sledi saditev potomcev v poljskem poskusu, odbira le najboljših po fenotipu in identifikacija staršev z molekularnimi markerji, ki je zaradi različnosti linij zelo zanesljiva. Za določitev potrebnega števila potomcev, ki izhajajo iz križanj med določenim številom linij, smo razvili tudi matematični model. S pomočjo opisane metode smo premostili največjo težavo pri žlahtnjenju hibridov, in sicer omejeno testiranje večjega števila linij in posledično določanje tistih linij, ki imajo najboljše kombinacijske lastnosti.
COBISS.SI-ID: 9287289
Viroidi so majhne, nekodirajoče, kovalentno zaprte krožne in enoverižne RNA molekule, velikosti med 239 in 401 nukleotidov ter so brez kapside. Za razmnoževanje potrebujejo gostitelja, pri čemer obstajajo viroidi, ki pri številnih ekonomsko pomembnih rastlinah povzročajo bolezni in viroidi, ki so latentni. Mehanizem njihove patogeneze vključuje direktno interakcijo genomske viroidne RNA z gostiteljevimi faktorji in post-transkripcijskim ter transkripcijskim utišanjem genov preko tvorbe majhnih viroidnih RNA molekul (vd-sRNA), ki jih proizvede gostiteljev obrambni mehanizem. Gostitelji številnih viroidov so tudi rastline hmelja (Humulus lupus). Hmeljev latentni viroid (angl. Hop latent viroid-HLVd) in viroid razpokanosti skorje agrumov (Citrus bark cracking viroid-CBCVd) se uporabljata kot modelna sistema za preučevanje interakcij med viroidi in gostiteljem. HLVd namreč povzroča nesimptomatsko okužbo in CBCVd hude bolezenske simptome pri okuženem gostitelju. Za boljše razumevanje interakcij viroidov z rastlino hmelja, smo na podlagi sekvenciranja RNA (RNA-seq) naredili primerjalno transkriptomsko analizo, katera je pokazala transkripcijske alternacije, ki so nastale zaradi okužbe hmelja s HLVd ali CBCVd. Dodatno smo s transkriptomsko analizo pri sočasni okužbi z obema viroidoma preučili učinek HLVd glede na agresivnost CBCVd, ki povzroča hudo zaostajanje v rasti hmelja. Naši rezultati so pokazali, da so v primeru okužbe s CBCVd spremembe v aktivnosti genov bolj dinamične, kot pri okužbi z samo HLVd ali pri hkratni okužbi. Diferenčno izraženi geni, ki so vpleteni pri obrambi rastline, fitohormonskemu signaliziranju, fotosintezi, kloroplastih, regulaciji RNA, procesiranju in vezavi RNA, metabolizmu in modifikaciji proteinov ter pri drugih mehanizmih, so bili bolj modulirani pri okužbi hmelja z CBCVd. Kljub temu je analiza klasifikacije genske ontologije (OG) in obogatenih poti pokazala, da je izražanje genov, ki so vključeni pri mehanizmu proteolize, bolj aktivno pri mešani okužbi, kot pa pri okužbi z samo enim viroidom. Iz tega lahko sklepamo, da sočasna okužba z viroidi povzroči močnejšo interferenco z gostiteljevimi faktorji. Če povzamemo, naši rezultati zagotavljajo podroben transkriptom hmelja in vpogled v interkacijo hmelja in viroida preko okužbe z samo HLVd ali CBCVd ter sočasne okužbe obeh viroidov.
COBISS.SI-ID: 9268089
Ohranjen mehanizem interferemce RNA (RNAi) je postal v kraljestvu gliv predmet številnih znanstvenih raziskovanj. Tri katalitične komponentne, protein Dicer-like (DCL), Argonavt (AGO) ter Od RNA odvisna polimeraza RNA (RdRP) ter z njimi asociirane male interferenčne RNA (siRNA) so bile identificirane ter okarakterizirane v številnih glivnih vrstah. Novejše študije ugotavljajo, da je RNAi pomemben akter virulence glivnih patogenov, kot posledica utišanja genov med kraljestvi organizmov. V študiji poročamo o obstoju vseh treh katalitičnih komponent RNAi v patogeni glivi Verticillium nonalfalfae, ki je talni pathogen, ki povzroča problematično bolezen venenja hmelja (Humulus lupulus L.). Identificirani so bili dva proteina DCL, dva AGO ter dve RdRP, v zaporedjih katerih smo okarakterizirali njihove ohranjene domene RNAi. Z analizo filogenije smo potrdili obstoječe taksonomske odnose znotraj skupine askomicetnih gliv in pokazali, da imajo glive podrazreda Hypocreomycetidae razreda Sordariomycetes visoko podobnost aminokislinih zaporedij. Z analizo izražanja genov smo odkrili potencialno vlogo mehanizma RNAi za patogenost glive, saj so vse identificirane komponente močno izražene v visoko virulentnem izolatu T2 glive V. nonalfalfae. Prav tako so geni diferencialno izraženi v odpornem (Wye Target) in občutljivem (Celeia) kultivarju hmelja.
COBISS.SI-ID: 9242233
CRISPR/Cas9 je vsestransko in učinkovito orodje za tarčno preurejanje genomov, ki se uporablja pri številnih rastlinskih vrstah. V naših poskusih smo primerjali dve najpogosteje uporabljeni metodi prehodne transformacije za tarčno preurejanje genomov, transformacijo protoplastov in infiltracijo Agrobacterium tumefaciens, da bi razvili hiter in učinkovit protokol za potrjevanje nastanka tarčnih mutacij. Vektorji, zasnovani za ciljanje štirih različnih regij v genomu zelja (dva modelna gena in dve različni regiji v genu za centromerni protein CENH3), smo vnesli v dve sorti rdečega zelja: 'Huzaro F1' in 'Rebecca F1'. Analiza sekvenciranja naslednje generacije je pokazala, da so vektorji CRISPR/Cas9 povzročili mutacije v obeh sortah in na vseh tarčnih mestih. Odstotki nastalih mutacij so bili od 1,27 do 11,95% po transformaciji protoplastov in od 0,07 do 14,42% po agroinfiltraciji. Naši rezultati kažejo uspešno tarčno mutagenezo z uporabo dveh različnih pristopov za hitro oceno učinkovitosti nastalih mutacij s CRISPR/Cas9 pri zelju. Rezultati so bili predstavljeni na mednarodni konferenci (Brassica 2018: 21st Crucifer Genetics conference, St. Malo, Francija) in letnih srečanjih Slovenskega genetskega društva.
COBISS.SI-ID: 9287545